梅花鹿IGF1全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达

为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA.根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFI基因特异引物并克隆IGFI基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR...     

鹿科动物茸角组织Osteopontin基因全长cDNA的克隆及表达分析

骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是在骨基质的矿化和吸收过程中起重要作用的细胞因子,研究首次从梅花鹿鹿茸尖端组织cDNA文库中成功克隆了OPN基因的全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列及表达特征进行分析。结果表明,OPN的cDNA全长为1 406 bp,编码279个氨基酸。经生物信息学分析,该基因为不稳定蛋白,具有N端信号肽,相对分子质量为30.99 ku,理论等电点为4.40,其一级结构中丝氨酸和谷氨酸残基所占比例最高,含有特异的Arg-Gly-Asp序列(RGD)。同源序列比对及系统进化树分析表明,鹿源OPN氨基酸序列不仅与欧洲牛和山羊相似性最高(分别为86%,85%),且在该基因座位上也与二者在亲缘关系最近。实时荧光定量RT-PCR分析表明,OPN基因在鹿茸尖端不同组织层的表达存在差异,前软骨层和软骨层的表达量普遍高于间充质和皮肤层,推测OPN可能通过介导破骨细胞与矿化组织的黏附,从而参与了鹿茸组织的矿化。     

鹿茸顶端组织IGF1R基因的部分cDNA克隆及差异表达

为了研究梅花鹿鹿茸顶端组织IGF1R基因的表达水平,采用TRIzoL试剂分别提取鹿茸真皮层、间充质层、前软骨层和软骨层总RNA,以逆转录酶AMV反转录合成cDNA,根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGF1R基因特异引物并克隆IGF1R基因,最后利用相对荧光定量Real-time PCR法检测IGF1R基因在...     

鹿茸不同生长期MALAT1基因的差异表达

以不同生长期的鹿茸尖端组织为材料,采用mRNA差异显示技术检测不同生长期鹿茸尖端间充质组织的差异表达基因。对其中一条差异表达片段进行克隆测序分析,得到400 bp左右的片段,与野猪的非编码基因MALAT1有高度同源性,同源性为90%。进一步实时荧光定量RT-PCR鉴定发现,该基因在鹿茸生长发育的前期和中期表达量高于后期,该基因在鹿茸快速生长期的上调表达暗示其在鹿茸生长发育过程中发挥作用,是鹿茸生长发育相关基因的候选基因。     

雌雄驯鹿茸皮组织ENO1基因cDNA克隆与表达

选用雌、雄驯鹿(Rangifer tarandus)顶端茸皮组织为试验材料,参考Genebank数据库中白尾鹿(Odocoileus virginianus)、牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)等同源物种的ENO1基因序列设计同源引物,采用PCR及T-A克隆技术以雄性驯鹿茸皮组织为材料克隆ENO1基因的c DNA序列,并运用荧光定量PCR技术对ENO1基因在雌、雄驯鹿茸皮组织中的表达量进行对比分析。结果表明:成功克隆获得驯鹿ENO1基因,其编码区片段大小为1 305 bp,共编码434个氨基酸;ENO1基因编码的蛋白的相对分子质量为47 342.09,其二级结构以α-螺旋为主;Blastp比对显示,驯鹿ENO1基因与羊、白尾鹿、牛的同源性最高,均为99%。构建系统进化树发现,驯鹿ENO1基因与白尾鹿的亲缘关系最近,与白头鹰(Haliaeetus leucocephalus)的亲缘关系最远;荧光定量PCR结果显示,ENO1基因在茸皮组织中的表达量在雌、雄之间存在差异,其中在雄性驯鹿茸皮组织中的表达量是雌性驯鹿茸皮组织中的(3.35±0.12)倍。     

东北狍PTN基因cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR方法、分子克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)PTN(pleiotrophin)基因cDNA序列。结果表明:获得的PTN基因cDNA序列长750 bp,共编码167个氨基酸,PTN蛋白分子质量为18.9 ku,理论等电点(pI)为9.66,是信号肽介导的一种亲水性蛋白质,其二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋和β-折叠,分别占46.71%、32.34%和20.96%;生物信息分析发现,东北狍PTN基因在进化上较为保守,与其他物种同源性均89%;构建的进化树表明,东北狍PTN基因与野牦牛、绵羊、野猪等偶蹄目动物亲缘关系较近,这一结果符合经典分类学规律;实时荧光定量RT-PCR分析显示,PTN基因在狍茸顶端组织不同生长层表达量存在显著差异,其中前软骨和间充质组织层的表达量明显高于皮肤和软骨组织层。     

梅花鹿VEGF基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了得到VEGF成熟肽基因,利用Trizol试剂法提取鹿茸顶端组织总RNA,反转录形成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关基因序列设计1对特异性引物,并克隆VEGF成熟肽基因,再利用免疫组化法检测VEGF基因在鹿茸顶端不同组织的表达水平。结果表明:成功获得梅花鹿VEGF成熟肽基因,该基因长495 bp,共编码164个氨基酸;经Blast同源性分析,结果显示与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.79%、97.98%、96.36%;经DNAMAN软件比对,其氨基酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%。免疫组化法结果显示,VEGF在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,其中在软骨层中表达水平较高。     

梅花鹿鹿茸组织PDGFA基因cDNA克隆及序列分析

为了探讨PDGFA基因的结构和功能,采用RT-PCR方法获得梅花鹿PDGFA基因,并运用生物信息学软件对其序列进行了分析。结果表明:梅花鹿PDGFA基因开放阅读框大小为591 bp,共编码196个氨基酸,蛋白的分子质量约为22 ku,理论等电点(pI)为8.53,是亲水性蛋白,具有信号肽。二级结构分析显示,含有47.45%无规则卷曲、39.29%α-螺旋、13.27%扩展链。进化分析显示,PDGFA蛋白与白尾鹿(Odocoileus virginianus texanus)、家牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)、野猪(Sus scrofa)、白犀牛(Ceratotherium simum)、小鼠(Mus musculus)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、原鸡(Gallus gallus)、绒啄木鸟(Picoides pubescens)的蛋白质序列相似度分别为98%、97%、96%、94%、93%、89%、81%、79%、78%。     

绵羊 PGRMC1 蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t孕激素受体膜组分1 (PGRMC1)在动物繁殖活动中有重要调节作用,本研究旨在探讨牦牛PGRMC1基因的序列及其在生殖轴的组织表达特性。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t试验采集5头牦牛和5头黄牛的下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫,以GenBank上已发布的普通牛PGRMC1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆牦牛和黄牛的PGRMC1基因,并使用相关的生物信息学软件对克隆所得序列进行分析;采用qRT-PCR法检测该基因在牦牛和黄牛不同组织中的表达情况。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t结果得到牦牛和黄牛PGRMC1基因cDNA序列(GenBank登录号：MF803753 和MF803754),编码区(CDS)全长都为585 bp,编码 194 个氨基酸。其编码蛋白中含有1个 Cyt-b5 保守结构域。qRT-PCR结果表明：PGRMC1基因在牦牛和黄牛下丘脑、脑垂体、卵巢、输卵管和子宫都有表达,牦牛和黄牛的垂体中的PGRMC1的表达差异显著(P<0.05),但在其他组织品种间差异不显著;牦牛PGRMC1在卵巢和垂体的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t本研究提示PGRMC1基因可能在牦牛卵泡发育、发情、排卵等繁殖机能调控中发挥重要作用。\t\t\t\t\t\t\t\t\t     

牛BMP3基因cDNA克隆及组织表达谱分析

用RT-PCR的方法克隆了鲁西黄牛BMP3基因1 555 bp的eDNA序列,该序列包含1个1 428 bp的完整开放阅读框,编码476个氨基酸残基;通过对推导的牛BMP3蛋白进行生物信息学分析发现,牛BMP3蛋白的分子量为53 506.27 D,等电点为9.42,该蛋白前22个氨基酸残基为信号肽序列,而亚细胞定位分析发现,该成熟蛋白可能位于细胞外.通过与最新公布的牛基因组比对,发现牛BMP3基因位于牛基因组第6号染色体上,由3个外显子和2个内含子组成,牛BMP3基因cDNA序列与人、小鼠、大鼠和鸡BMP3基因cDNA序列的相似性分别达到84%,81%,81%,79%,是进化上保守的基因.在牛卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺等组织中都检测到BMP3基因表达,表明牛BMP3基因是一个功能重要、进化保守的基因,具有广泛的组织表达谱.     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

鹿茸间充质细胞全长cDNA文库的构建

解剖梅花鹿鹿茸,取得间充质,经过胰酶消化,体外培养鹿茸间充质细胞。利用TRIZOL提取鹿茸间充质细胞总RNA,利用BD SMART技术构建鹿茸间充质细胞全长cDNA文库,测定该文库初级文库滴度为3.0×105 pfu/mL,扩增文库滴度为6.0×108 pfu/mL。插入片段长度大于500 bp。     

甜荞硫氰酸生成酶cDNA片段的克隆与序列分析

硫氰酸生成酶(Rhodanese,EC2.8.1.1),也称硫代硫酸盐硫基转移酶(Thiosulfate sulfurtransferase,TST),是一种线粒体基质酶,该酶通过催化硫代硫酸盐中的1个硫原子转移到氰化物或巯基化合物,使氰化物和H2S毒性降低,在硫氰酸生成酶的催化下,与氰离子结合转变为毒性甚微的硫氰酸盐从肾排出[1].     

家兔Dmrt1全长cDNA的克隆和组织表达

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和RACE的方法克隆了家兔Dmrt1全长cDNA基因.氨基酸序列分析表明,家兔Dmrt1与其他哺乳类Dmrt1基因的氨基酸序列同源性较高,而与鱼类、两栖类、鸟类等氨基酸序列的同源性较低.RT-PCR分析表明,Dmrt1基因只在家兔的精巢和卵巢中表达,而在脑、垂体、肺、心脏、肝脏、肠、脾脏、肾、肌肉等组织中均不表达,且精巢中的表达量高于卵巢.这一结果表明,Dmrt1可能参与了家兔的性别决定过程.     

鸡D28k钙结合蛋白cDNA的克隆与序列分析

根据已发表的鸡D28k钙结合蛋白(CaBP—D28k)基因序列设计合成1对引物,利用RT—PCR技术从新扬州鸡小肠组织RNA中扩增出鸡CaBP—D28k cDNA,并克隆至pGEM—T中,经PCR、XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定测序后,用DNAStar软件对克隆出的cDNA进行同源性分析。结果表明：新扬州鸡CaBP—D28k基因片断长为18．5kb,与GenBank中的CaBP—D28k基因具有高度的同源性(99．2％),在开发阅读框内仅有一个碱基的差别,中间没有出现缺失和插入,证明所得到的是鸡CaBP—D28k cDNA。     

马铃薯StKN1基因的cDNA克隆与分析

植物同源异型枢基因(Homeobox gene,HBG)广泛存在,是一类重要的转录因子编码基因,在生物进化中具有很强的保守性。利用GenBank登录的拟南芥、苜蓿、豌豆、烟草、番茄等同源异型枢基因保守区序列设计简并引物,通过RT-PCR技术,从马铃薯萌动的幼芽中获得了一个homeobox的cDNA基因,命名为StKN1,GenBank登录号为DQ494855.1。该基因片段长971 bp,经序列分析比对,与其他植物的HBG具有很高的序列相似性。系统进化分析将StKN1基因归入homeobox KNOX基因家族。