落叶松-杨栅锈菌致病性分化研究

对采自山西、吉林、黑龙江、内蒙古、四川、甘肃、青海、北京等省(市)的11个落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)分离物进行了鉴别寄主反应型测定以及潜育期、产孢量的观察,结果表明,落叶松-杨栅锈菌存在较明显的生理分化,并将其分为3个致病类群.类群Ⅰ包括青海、吉林、黑龙江、甘肃以及陕西宁陕、周至的6个分离物;类群Ⅱ包括四川、内蒙古和陕西宝鸡、太白的4个分离物;类群Ⅲ为北京的1个分离物.     

落叶松-杨栅锈菌重寄生菌的生物学特性研究

通过分离培养,发现落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)的重寄生菌主要有Cladosporium tenuissimum、Alternaria sp.Penicillium sp..对C.tenuissimum的生物学特性研究表明,该菌在PDA培养基上的生长适温为25～30℃,在pH为3～11时均可生长和产孢,最适pH为4～6.在对碳源的利用上,以果糖、葡萄糖生长最好,麦芽糖、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖、蔗糖等均可以生长.随着葡萄糖浓度的增加,其菌落直径、菌丝致密程度和产孢     

中国落叶松-杨栅锈菌生理小种鉴定

对来自全国7个省市一定地域、不同年份、不同批次的15个落叶松-杨栅锈菌菌系 进行了 鉴别寄主反应型测定以及潜育期、产孢量观察,进一步明确了落叶松-杨栅锈菌在我国的 生理小种 分化。结果表明,15个菌系中的13个分别属于4个生理小种,Th 053 、Sb和Cj 052 归1号生理小种 CMLP 1 ,Ts 06 、Gl 051 、Hb 05ˉ1 和Sb 052 归2号生理小种CMLP 2 ,Qh 063 、Gl 052 、Hdao和Sb 051 归3号生理 小种CMLP 3 ,Bq和Qh 061 归5号生理小种CMLP 5 ,By 05ˉ3 和Zs暂单独划为1个致病类型。     

落叶松－杨栅锈菌 MKK基因的克隆与生物信息学分析1）

利用同源克隆技术,从落叶松－杨栅锈菌（ Melampsora larici-populina Kleb．）菌株Wh03中克隆得到酿酒酵母MKK1和MKK2的同源基因,命名为MlpMK K1／2－WH。测序结果显示,MlpMKK1／2－WH基因的开放阅读框长度为1218 bp,编码405个氨基酸。 MlpMKK1／2－WH蛋白具有保守的PKc＿Pek1＿like和Pkinase结构域。系统进化树分析表明,MlpMKK12／－WH与柄锈菌属3种锈菌中的同源蛋白亲缘关系最近。     

中国落叶松杨栅锈菌4个流行小种的RAPD标记

以156条随机引物,对目前中国落叶松杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb)的主要优势菌系进行了RAPD片段的筛选,寻找到了1号3、号4、号5、号4个流行生理小种的特异性RAPD标记。经过多批次扩增,引物S205和S284分别得到1号生理小种长度约450和760 bp的特异条带,S25得到3号生理小种长度约1440 bp的特异条带,S51和S286得到4号生理小种长度约970和1020 bp的特异条带,S23和S96分别得到5号生理小种长度约750和780 bp的特异条带。此结果表明,通过寻找落叶松杨栅锈菌生理小种的特异性RAPD片段,能够建立起中国落叶松杨栅锈菌生理小种的分子检测体系。     

落叶松—杨栅锈菌生理分化研究

对采自太白山、火地塘和天台山等地的５个菌样进行鉴别寄主反应型测定及潜育期、产孢量观察,并对诸菌样的可溶性蛋白质进行了电泳分析。结果表明,落叶松—杨栅锈菌（Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａｌａｒｉｃｉ－ｐｏｐｕｌｉｎａＫｌｅｂ．）在秦岭地区存在着生理小种分化。初步将其分为ＭＬＰ１、ＭＬＰ２和ＭＬＰ３３个生理小种。     

落叶松-杨栅锈菌DNA提取新方法研究

对提取DNA“二球法”的一些步骤和提取成分进行了更新,使得PCR反应灵敏性显著增加。改进的 内容包括:(1)在有二钢珠和1．6 g／L Chelex的离心管中加入夏孢子,夏孢子可以来自带有风干寄主叶肉组织的夏 孢子堆;(2)在离心管中加入KOH而不是NaOH,然后剧烈斡旋30 min;(3)将离心管管底穿一小孔,套上一新离心 管,短暂离心甩出内容物。用该方法得到的DNA可用作ITS-nrDNA-PCR,RAPD和SSR的底物。同时,分析了 PCR扩增中提取上液的稀释倍数,发现RAPD和SSR扩增稀释倍数达到16倍以上有较好的反应结果。     

叶锈菌对不同杨树品种叶片木质素的影响

通过对不同抗性的杨树寄主在不同接种时间段的木质素的沉积进行了跟踪。染色后观察发现:在受到落叶松-杨栅锈菌侵染后1～2d不亲和组合叶肉组织中木质素积累就很多,3d后积累比较明显。木质素积累的整个进程基本表现为木质素积累在近免疫、高抗品种较多,感病品种中很少,而免疫品种中无明显变化。     

落叶松-杨栅锈菌MlpNHA1-like基因的克隆及序列分析

落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病是杨树的一种重要病害。通过系统发育分析和序列相似性比对确定落叶松-杨栅锈菌标准菌株基因ID 45128为酿酒酵母NHA1直系同源基因以及基因ID 116278为NHA1相关基因,分别命名为MlpNHA1和MlpNHA1-like。以夏孢子cDNA为模板,运用RT-PCR技术,同源克隆获得中国菌株MlpNHA1-like基因的ORF片段,即MlpNHA1-like (wh03),长度为1 545 bp,编码514个氨基酸。结果表明,生物信息学预测分析显示MlpNHA1-like (wh03)蛋白具有与酿酒酵母NHA1蛋白相同的保守结构域c_cpa1,且同样具有系列疏水跨膜结构,亚细胞定位预测结果表明目的蛋白分布在质膜区域。通过克隆落叶松-杨栅锈菌中国菌株MlpNHA1-like基因并开展序列分析,为解析该锈菌MlpHOG1蛋白介导通路在病原菌侵染致病及响应外界胁迫中的作用提供帮助。     

落叶松-杨栅锈菌夏孢子萌发条件研究

以落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)的Th053(Th)和Gl051(Gl)菌系为材料,通过研究不同温度、不同琼脂糖浓度及叶片浸出液对夏孢子萌发的影响,分析影响夏孢子萌发的因素。结果表明:(1)在供试温度范围(0~30℃)内,琼脂糖浓度对夏孢子萌发没有显著影响,但最高温度(32℃)时,高琼脂糖浓度对夏孢子的萌发有明显的促进作用;(2)夏孢子萌发的最适温度为20℃,最低萌发温度为5℃,最高萌发温度为32℃,高于32℃几乎不萌发。在最适温度下,Th菌系6~8 h萌发速率最大,24 h累计萌发率达63.40%;Gl菌系4~6 h萌发速率最大,前24 h累计萌发率达60.28%;(3)不同浓度的太白杨叶片浸出液对该锈菌夏孢子萌发有不同程度的影响,10 g.L-1的水浸液对夏孢子萌发有明显的促进作用,但高浓度的水浸液、叶组织粉碎抽取液对夏孢子萌发具有抑制作用。     

陕西关中落叶松杨栅锈菌夏孢子流行规律分析

利用夏孢子捕捉技术和灰色预测理论,对青杨叶锈病病原菌落叶松杨栅锈菌夏孢子在陕西关中地区的流行规律进行初步研究,结果显示：该菌夏孢子8月左右开始传播,山间9月中旬达到最大传播程度,平原10月中旬达到最大传播程度,11月上旬末夏孢子传播结束;STC样地夏孢子流行规律的数学模型为：Xt = 8108×e-049 t;由该病原菌引起的青杨叶锈病发病于关中西部,并逐渐由西向东,由低纬度向高纬度,由高海拔向低海拔地区蔓延,山间发病早于平原。     

杨树对落叶松-杨栅锈菌抗性生理机制研究

采用叶盘法对供试寄主杨树进行落叶松-杨栅锈菌夏孢子人工接种处理,研究了杨树对落叶松-杨栅锈菌抗病性的生理机制。结果表明,接种病原菌后1～8 d,6种杨树的PAL、PPO、几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性均升高,且酶活性的变化与树种的抗性表现了较好的正相关。抗病较强的美黑01和中绥12号接种病原菌后,PAL、PPO、几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性不仅升高幅度大,而且这些酶活性绝对值也明显高于抗病性较弱(或感病)树种中林美荷、69杨等。同时抗病较强的树种中这些酶高活维持的时间也较长。这些变化促进了抗病物质的形成和积累,从而表现出抗病性。从几种酶活性测定的总体结果来看, PAL和几丁质酶在受侵各杨树种(品种)体内的活性增幅较其他酶类明显较高,故这几种酶可作为杨树抗叶锈病的生理指标。     

杨树与栅锈菌互作中生理代谢变化

对受栅锈菌侵染后的杨树体内代谢指标进行了测定,研究了杨树受不同致病性的落叶松-杨栅锈菌侵染前后的病理生理学变化。结果表明,受锈菌侵染后,寄主可溶性总糖含量先降低再升高,而还原糖和可溶性蛋白质含量的病/健比一直小于1;与之相反,游离氨基酸含量的病/健比则一直大于1。CAT的活性在接种后的48～96 h中达到最大,POD、SOD的活性在接种后的24 h后就高于对照,且逐渐升高,并在显症前达到峰值。在不同亲和性的组合中的生理变化以感病组合中最显著,这些生理变化与抗病性有一定的关系,可作为检测杨树抗锈性生理生化指标。     

C14 族R2R3鄄MYB 基因调控杨树抗锈菌过敏性反应

由落叶松-杨栅锈菌引起的杨树叶锈病分布广泛,危害严重。为探究杨树C14族R2R3-MYB基因在杨树抗锈菌过敏性反应中的调控作用,对接种了落叶松-杨栅锈菌E4强致病性生理小种的2种杨树叶片进行症状观察、感病指数判定并对2种杨树C14族共6条R2R3-MYB基因表达量变化情况进行分析。接种7 dpi后,弱感病性树种杂交杨叶片产生的夏孢子堆数量显著少于感病树种欧美杨。杂交杨叶片4 dpi开始出现过敏性反应症状,欧美杨未观察到类似症状。表明过敏性反应可有效阻止锈菌夏孢子堆形成,降低杨树感病性。杂交杨与欧美杨R2R3-MYB基因表达量变化趋势相反,预测杨树C14族R2R3-MYB基因为杨树与病原互作过程中调控过敏性反应的正向调控因子。本研究为进一步系统研究杨树R2R3-MYB基因与过敏性反应的调控机理及杨树抗病育种工作提供理论依据。      

不同抗锈病杨树品种防御酶活性变化的研究

选择7个抗性不同的杨树品种N177(锈病免疫树品种)、03-04-111、03-04-97、I108(抗锈病品种)、03-04-141、03-04-170(感病品种)、青13(乡土品种)为研究对象,进行了染病与健康叶片5种防御酶活性的对比分析。结果表明:不同抗性杨树品种受落叶松-杨栅锈菌浸染后,5种酶的活性均比健康叶片高,其中PAL的活性提高了2.3%～107.0%、PPO活性提高了1.7%～234.4%、POD活性提高了9.3%～104.1%、几丁质酶活性提高了10.1%～70.0%、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性提高了2.3%～66.2%;感染落叶松-杨栅锈病后,每个杨树品种的防御酶活性变化差异较大,其中抗锈病品种的PPO、PAL酶活性增量最大,锈病免疫树品种的几丁质酶活性增量最大,乡土品种的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性增量最大,而感病品种的5种酶活性变化幅度均较低。综合结果表明,在杨树抗锈病研究中,可用PPO、PAL酶活性作为选择抗性品种参考指标,几丁质酶活性作为选择免疫品种参考指标。     

杨树与叶锈菌互作中的细胞程序性死亡

用落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)菌系Gl052和Sb052分别接种抗病川杨(Populus szechuanica)与感病太白杨(P.purdomii)叶片,对叶肉细胞核进行荧光染色观察及基因组DNA Ladder条带检测,初步探讨杨树与锈菌互作过程中的寄主细胞程序性死亡进程.结果表明:抗病品种川杨受落叶松-杨栅锈菌侵染后有过敏性坏死现象,DNA Ladder检测发现有降解的DNA小片段,染色观察发现接种0.5 dpi细胞核开始发生变化,3～4 dpi细胞核裂解,7 dpi细胞核消失,表现出明显的细胞程序性死亡特征,在DNA电泳图谱上观察到明显的梯状DNA条带.感病品种太白杨受该叶锈菌侵染后未检测到降解的DNA小片段,荧光染色观察细胞核也未明显变化,未明显表现出PCD特征.     

中国落叶松-杨栅锈菌生理小种鉴定

对来自全国7个省市一定地域、不同年份、不同批次的15个落叶松-杨栅锈菌菌系进行了鉴别寄主反应型测定以及潜育期、产孢量观察,进一步明确了落叶松-杨栅锈菌在我国的生理小种分化.结果表明,15个菌系中的13个分别属于4个生理小种,Th053、Sb和Cj052归1号生理小种CMLP1,Ts06、Gl051、Hb05-1和Sb052归2号生理小种CMLP2,Qh063、Gl052、Hdao和Sb051归3号生理小种CMLP3,Bq和Qh061归5号生理小种CMLP5,By05-3和Zs暂单独划为1个致病类型.     

镉胁迫对欧美杂交杨(Populus deltoides×Populus nigra)光合作用与生物量生产的影响

采用盆栽实验研究了生长在四川盆地典型Cd污染冲积土和紫色土上的欧美杂交杨(Populus deltoides×Populus nigra)对国家土壤环境质量标准中Cd浓度梯度(0、0.3、1.0、2.0 mg/kg)的光合响应和生物生产量。Cd处理显著降低紫色土上生长的杨树叶绿素a和叶绿素总量,增加气孔导度与胞间CO2浓度,增加凋落叶生物量,降低茎生物量、根生物量和单株总生物量。但是,Cd处理对冲积土上生长的杨树叶绿素特征、光合生理指标和生物量生产并无明显差异。尽管同一生长基质上不同Cd处理间杨树光合生理指标与生物量生产均有一定程度的影响,但紫色土上生长的杨树生理和生长特征均显著低于冲积土上生长的杨树。这些结果表明,自然条件国家土壤环境质量标准内,Cd污染并不对杨树生长构成较大威胁,而生长土壤基质的选择可能对杨树的栽培更为重要。这为Cd污染土壤区域城市森林建设和速生丰产林建设提供了一定的科学依据。     

Pb胁迫对欧美杂交杨（Populus deltoides×Populus nigra）生物量分配格局及其Pb富集特性的影响

采用速生树种修复重金属污染土壤的方法近年来受到越来越多关注,但已有结果存在很大不确定性。为了解杨树在不同Pb胁迫条件下生长响应和Pb富集效果,以长江上游两种典型土壤(酸性紫色土和钙质紫色土)为栽培介质,采用盆栽试验方法,研究了不同Pb浓度处理下(CK:0mg·kg-1;T1:200mg·kg-1;T2:450mg·kg-1;T3:2000mg·kg-1)欧美杂交杨(Populus deltoides×Populusnigra)生物量生产与分配格局以及Pb吸收、富集特性。两种土壤条件下杨树各器官生物量及总生物量均表现出随Pb胁迫程度的增加而降低的趋势,Pb胁迫条件下杨树生物量分配格局在钙质紫色土中表现为茎>粗根>叶>细根。相同浓度Pb处理条件下,单株杨树总生物量均表现为钙质紫色土大于酸性紫色土。随着Pb处理浓度的增大,杨树各器官Pb含量及积累量显著增加。Pb胁迫使杨树对Pb的富集系数逐渐增大而耐性系数逐渐减小。T3处理条件下杨树对Pb的富集系数在酸性紫色土中较大,且各处理条件下杨树对Pb的耐性系数均为酸性紫色土中较大。这些结果表明,高浓度Pb胁迫条件下酸性紫色土中的欧美杂交杨表现出较好的吸收和富集Pb的特性,这为Pb污染土壤的生物修复提供了一定的科学依据。     

甘蔗14-3-3基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗14-3-3基因并预测分析其编码蛋白的结构,为研究甘蔗基因功能和代谢调控机制提供参考.[方法]以水稻14-3-3基因为模板,BLAST甘蔗EST数据库,依据序列拼接结果及RT-PCR技术获得编码甘蔗14-3-3蛋白的全长基因,并用生物信息学方法对该蛋白的二级、高级结构和功能活性位点进行预测.[结果]克隆得到长784bp的甘蔗14-3-3基因,最大开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸;该蛋白的分子量与理论等电点分别为28.88 kDa和4.79.蛋白聚类分析结果表明,甘蔗14-3-3蛋白与水稻、高粱、玉米14-3-3蛋白的同源性均在90％以上.Cn3D V.4.1预测位于第3和第5两个二聚体上的Lys-50、Arg-57、Arg-131和Try-132组成一个凹穴,是结合靶蛋白的作用面;第60、65、188、218位的4个丝氨酸是磷酸化的活性位点.实时定量PCR检测结果表明,14-3-3基因在甘蔗不同组织中均有表达,在茎和分生组织中14-3-3基因高丰度表达,可能与糖代谢和细胞分裂的调控相关;而在根中可能参与矿物元素的吸收和代谢.[结论]甘蔗14-3-3基因可作为信号转导调控蛋白的候选基因之一.