苹果树腐烂病菌活性物质的提取分离及结构鉴定

为探索苹果树腐烂病菌(Valsa mali)野生型菌株03-8产生的活性物质及其与致病性的关系,在以蔗糖为碳源的MS液体培养基中25℃静置培养20d,利用大孔树脂吸附、二氯甲烷萃取、薄层层析和高效液相色谱等手段分离纯化,~1H-NMR、~(13)C-NMR、DEPT135、HMQC谱对纯化合物进行结构鉴定,并测定其生物活性。最终分离得到一个化合物D-2;结构鉴定为1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇;该化合物1mg/mL的丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液不能在烟草和苹果叶片上引起坏死斑,但对枯草芽孢杆菌有抑制作用。     

苹果树腐烂病菌小G蛋白VmRab7基因的功能分析

苹果树腐烂病菌（Valsa mali）引起的真菌病害严重制约着苹果经济产业的发展,深入研究其致病机制,对该病害的防控十分重要。初步鉴定了小G蛋白VmRab7的功能,为解析苹果树腐烂病菌的致病机理和病害防控提供理论依据。采用同源重组的方法对VmRAB7进行基因敲除,获得ΔVmrab7敲除突变体;通过菌落直径的测量,分析VmRab7对菌丝生长速率的影响;通过离体枝条和叶片接种,分析VmRab7对致病力的影响;通过透射电镜观察,分析ΔVmrab7突变体的自噬体及液泡形态。研究发现,VmRAB7基因的缺失使菌丝生长速率降低了约40%,致病力降低了约50%,突变体丧失了产孢能力;ΔVmrab7敲除突变体具有小且多的碎片化液泡,液泡中无球状的自噬体结构。因此,VmRab7调控着苹果树腐烂病菌的营养生长、产孢、致病力、液泡融合和细胞自噬过程。     

苹果树腐烂病菌分生孢子产生条件研究

[目的]为了给生产实践中苹果树腐烂病研究提供一种获得分生孢子的方法。[方法]在室内测试苹果树腐烂病菌在6种培养基上的分生孢子产生条件,比较每种培养基上产生的分生孢子器个数、密度、大小、成熟率以及单个分生孢子器所含孢子数量等。[结果]PDA（添加马铃薯）、ABA（添加苹果树皮）培养基在各项参数对比中显著优于其他培养基。其中,PDA上产生的分生孢子器数量最多,ABA上产生的分生孢子器成熟率最高,产生成熟子实体的时间最短;黑光灯照射（紫外照度为53.5μW/cm2）有利于苹果树腐烂病菌分生孢子器的产生和成熟。[结论]提供了一种较为方便的室内获得苹果树腐烂病孢子的方法。     

环境因素对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发与存活的影响

随着现代工业的发展,很多以前很少出现的细菌都萌生出来,在果树种植业中,苹果树腐烂现象近年来表现的越来越严重。正因如此,国内很多专家学者对此都进行了详细的研究,研究表明,苹果树腐烂主要是因为苹果树腐烂病菌的感染越来越严重,对此,通过对苹果树观察的经验以及对研究者研究结果的分析,找出了有关苹果树腐烂病菌分生孢子萌发和存活的环境影响因素。本文一开始对有关苹果树腐烂的研究进行分析,然后找到影响苹果树腐烂病菌分生孢子萌发和存活的影响环境因素。     

影响苹果树腐烂病菌侵染致病的流行因子

[目的]腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树.论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据.[方法]通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖...     

修剪工具对苹果树腐烂病菌的传播作用

为明确修剪工具能否传播苹果树腐烂病菌以及不同的修剪时间对苹果树腐烂病菌传播和侵染的影响,2011—2013年连续2个年度进行不同时间分别用带菌和不带菌修剪工具进行剪枝的试验。结果表明,带有腐烂病菌的修剪工具能够在修剪过程中传播苹果树腐烂病,并且与12月、1月、2月相比,选择在3月份进行集中修剪,发病率最低。     

甘肃省苹果树腐烂病菌ITS序列分析及潜育期研究

为了明确甘肃省苹果树腐烂病菌的种类及其优势种的潜育期,通过ITS序列比对和离体枝条接种法对采自甘肃省不同地区的苹果树腐烂病菌进行了ITS序列测定、分析及潜育期研究.结果表明:甘肃省苹果树腐烂病菌有2个种,分别为Valsa mali和Valsa malicola,其中Valsa mali有2个变种,分别为Valsa mali var.mali和Valsa mali var.pyri.甘肃省苹果树腐烂病菌优势种Valsa mali的潜育期随保湿时间增加而缩短,保湿时间为72h时潜育期为74.3h;温度30℃时潜育期最短,为64.3h;潜育期随枝龄的增加而增加,嫩梢的潜育期为46.3h;光暗交替下潜育期最短,为45.3h.     

苹果树腐烂病菌挥发性代谢物及其毒素活性

研究苹果树腐烂病菌代谢产生的挥发性物质及其毒素活性。通过在树皮培养基中培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,并利用苹果枝条对其标准物质进行毒素活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生5种挥发性物质,分别为2-氟丙烯、异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚,其中异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚均对苹果树枝具有毒素活性。苹果树腐烂病菌产生的挥发性代谢产物对苹果树具有毒素活性,为苹果树腐烂病菌致病机理的探索提供新的思路与方向。     

苹果树腐烂病菌拮抗枯草芽孢杆菌E1R-j抗菌蛋白的分离纯化

【目的】从枯草芽孢杆菌E1R-j菌株的发酵液中分离纯化抗菌蛋白,分析确其对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制作用,为更好地利用该菌株防治植物病害和研制生物农药奠定基础。【方法】采用盐酸沉淀法从E1R-j发酵液中提取粗蛋白,并筛选酸沉淀的最佳pH值,然后通过反相柱RESOURCETMRPC、凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析技术,提取并分离纯化粗蛋白;在粗蛋白分离纯化过程中,以皿内对峙试验测定蛋白的抗菌活性;通过扫描电镜技术,观察抗菌蛋白对病原菌菌丝的抑制作用。【结果】以pH 4.0盐酸沉淀获得的粗蛋白活性最强,抑菌效果最佳。反相柱RESOURCETMRPC获得的活性峰收集物经凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析后,得到1个对称的活性峰,其收集物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测为单一条带,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱中显示有2个分子质量相近的条带,表明该抗菌蛋白可能含有2个亚基,2个亚基的分子质量分别为55和60ku,将该活性蛋白命名为EP-1。扫描电镜结果显示,抗菌蛋白EP-1可使苹果树腐烂病菌菌丝出现膨大、弯曲以及原生质外渗等现象。【结论】通过盐酸沉淀及柱层析技术,从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离纯化出一种分子质量为115ku的抗菌蛋白EP-1,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显的抑制和破坏作用。     

钾元素对苹果树腐烂病菌生长发育的影响

本研究在室内测试了不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌生长速率、菌丝形态、菌丝干重、分生孢子萌发及致病力的影响,旨在为寻找更有效的抗腐烂病菌靶标提供理论基础。在基础培养基PDA和PDB中分别添加不同量KCl粉剂,配制成含不同浓度钾的培养基,通过生长速率法、菌丝干重法、孢子萌发法和伤口接种法研究钾元素对腐烂病菌的影响。结果表明：纯钾浓度低于9.04 g/L时能促进腐烂病菌菌丝生长,当浓度高于9.04g/L时则抑制菌丝生长,同时,该浓度下的分生孢子孢子萌发率也出现显著下降。当纯钾浓度达到12.82 g/L时,腐烂病菌菌丝生长、孢子萌发和致病性都受到显著抑制;从19.16 g/L高浓度钾处理菌株接种的病果上分离获得的腐烂病菌菌株KVm470,其致病力与野生型Vm470相比显著下降。因此,树体中保持合理浓度的钾含量除了提高树体抗病性之外,还能够显著抑制腐烂病菌的侵染和扩展,而且,钾元素对腐烂病菌致病力的影响具有一定程度的可遗传性。     

苹果树腐烂病菌生长发育相关突变体筛选及侧翼序列分析

由弱寄生菌苹果黑腐皮壳属真菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是苹果枝干上的重大病害。探究病菌生长发育的分子机制对于新农药靶标位点的开发具有重要理论意义。在前期建立的苹果树腐烂病菌ATMT突变体库的基础上,利用PDA培养基常规培养法,对野生型菌株03-8及230株供试突变体菌株的菌落形态、大小以及繁殖体产生情况进行观察分析,筛选得到表型发生变化的突变体共67株(占突变体总数的29.13%)。其中11株突变体的菌落大小异常(4.78%);25株突变体的菌落颜色发生变化(10.87%);18株突变体的菌落边缘变为不规则(7.83%);9株突变体的繁殖体最初形成时间推迟至50d左右(3.91%);17株(7.39%)突变体的繁殖体产生数量发生显著变化。利用TAIL-PCR对10株表型变化的突变体进行侧翼序列扩增,获得3条T-DNA侧翼序列,序列分析发现1个为细胞色素氧化酶1(cytochrome oxidase 1),其他2个均为含有核糖体L34(Ribosomal L34)的假想蛋白。筛选获得67个生长发育受到影响的突变体,并鉴定得到2个候选的调控病菌生长发育的相关基因,为揭示苹果树腐烂病菌生长发育的分子机理奠定基础。     

PEG分级法检测绿竹叶片双向电泳中的低丰度蛋白

蛋白质组学研究的关键问题之一是双向电泳(2-DE)中低丰度蛋白的分析,主要是因为相关高丰度蛋白的存在,导致IPG胶条无法吸胀低丰度蛋白,使得低丰度蛋白在2-DE中很难被检测出来。利用梯度浓度的PEG4000沉淀方法来富集绿竹叶片中不同丰度的蛋白质,从而使得低丰度蛋白在凝胶中显现出来。在PEG分级法和传统的全蛋白提取法的2-DE比较中,发现采用PEG分级沉淀法提取的蛋白质的数量以及类别明显增加,高丰度蛋白主要富集在8%和16%的PEG浓度组分中,使得其他组分中的低丰度蛋白与高丰度蛋白组分分别进行2-DE分析。经过对图像和数据的比较、分析,PEG分级法得到的5个组分蛋白点总数超过了1032个,大约是传统蛋白提取方法制备蛋白样品的3倍。     

橡胶树胶乳全蛋白的提取及双向电泳分析

以橡胶树无性系RRIM600为材料,采用TCA（三氯乙酸）-丙酮沉淀法提取胶乳全蛋白,17cmpH5～8固相pH梯度预制干胶条和快速银染法对提取的蛋白进行分离和染色,所得到的电泳图谱背景清晰,横条纹和竖条纹少,且蛋白点数量多。通过本研究获得了高分辨率的胶乳全蛋白双向电泳（2-DE）图谱的方法,为进一步开展橡胶树胶乳全蛋白质组学研究奠定了基础。     

肽文库富集荷斯坦奶牛血浆和血清中低丰度蛋白的效果研究

【目的】获取牛血浆和血清蛋白质组中低丰度蛋白的表达信息。【方法】采用肽文库试剂盒ProteoMiner富集荷斯坦奶牛的血浆和血清,运用二维凝胶电泳结合液相色谱串联质谱方法,分析富集前后血浆和血清中蛋白的变化。【结果】牛血浆和血清经ProteoMiner试剂盒富集,白蛋白含量显著下调(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01),载脂蛋白E显著增加(血浆和血清的差异显著水平分别为P=0.02和P=0.01)。【结论】该法在降低牛血浆和血清中高丰度蛋白的同时有效富集了低丰度蛋白,有利于血浆和血清中低丰度蛋白质组的研究。     

壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌菌体蛋白差异表达分析

建立了有效分析浅玫瑰色链霉菌菌体全蛋白质的方法,使用分离范围为p H 4~7的IPG胶条、2D clean-up试剂盒法纯化方法、80μg蛋白质上样量和银染的双向电泳技术,获得了低背景、高分辨率和重复率、无明显条纹的浅玫瑰色链霉菌全蛋白质双向电泳图谱。通过Image Master2D Platinum7.0软件对壳聚糖诱导条件下浅玫瑰色链霉菌菌体总蛋白质的电泳图谱进行匹配分析,在诱导菌株图谱上有723±14个清晰可见的蛋白质点可供差异分析。与未诱导菌株的双向电泳图谱对比结果显示:18个蛋白质点在诱导菌株中差异表达,其中14个蛋白质点的表达量上调,4个蛋白质点的表达量下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定,结果显示,延长因子Tu、RNA聚合酶、分子伴侣等蛋白在壳聚糖诱导下表达量增加,表明它们在浅玫瑰色链霉菌代谢壳聚糖的过程中起重要作用。     

天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立

【目的】探索一套适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系,为研究其种子萌发过程中的蛋白表达差异奠定基础。【方法】比较蛋白的不同提取方法(酚提取法、三氯乙酸-丙酮-酚提取法、三氯乙酸-丙酮法和Tris-HCl法)、IPG胶条pH梯度(pH3～11NL、pH3～10和pH4～7)、裂解液中的尿素浓度(6,7,8,9mol/L)和分离胶浓度(10%和12.5%)等条件,对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响,筛选适宜的双向电泳条件。【结果】以Tris-HCl法提取种子蛋白,在IPG胶条pH为4～7、裂解液中尿素浓度为9mol/L、分离胶浓度为12.5%的条件下,可以获得分辨率高、背景清晰、重复性好的天女木兰种子蛋白双向电泳图谱。【结论】建立了适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系。     

适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris鄄酚法、三氯乙酸/ 丙酮法和三氯乙酸/ 丙酮+ Tris鄄酚法对其蛋白质提 取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest 软件和质谱对这3 种提取方法得到的双向电泳胶进行分 析。结果显示,三氯乙酸/ 丙酮法得到的蛋白点数量为231 ±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57 ±0.618) mg/ g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。      

小麦叶片蛋白质组分析中高丰度蛋白Rubisco酶的快速去除方法研究

【目的】建立一种小麦叶片蛋白质组分析时去除全蛋白提取物中高丰度蛋白Rubisco酶的方法,为富集低丰度蛋白,提高双向电泳灵敏度提供技术支持。【方法】采用分离技术,以铭贤169小麦苗期叶片为材料,使用不同浓度(1,2,5,10 mmol/L)的肌醇六磷酸钠,结合二水氯化钙在不同温度(4,20,37℃)去除小麦叶片蛋白中的Rubi-sco酶,筛选去除小麦叶片蛋白Rubisco酶的最佳条件,并采用一维凝胶电泳(1-DE)、Western blot方法检测去除Rubisco酶的有效性,用二维凝胶电泳(2-DE)评估该方法对样品在二维凝胶上分辨率的影响。【结果】在37℃条件下,采用10 mmol/L肌醇六磷酸钠结合10 mmol/L的二水氯化钙去除小麦叶片蛋白中的Rubisco酶,可以获得较好的去除效果。在上述条件下作用10 min,小麦叶片水溶性蛋白提取物中超过80%的Rubisco酶得以沉淀去除,二维电泳图谱上有更多的低丰度蛋白点显现,且水平条纹明显减少,分辨率有所提高。【结论】得到了一种用于小麦叶片蛋白质组分析时去除高丰度蛋白Rubisco酶的方法,该方法具有快速、高效、成本低的特点。     

基于SFE-GC/MS技术的敌敌畏在柳树中的传导与分布

建立了一种利用超临界CO2萃取-气质联用(SFE-GC/MS)技术测定树干注药后柳树中敌敌畏残留量的分析方法。超临界CO2萃取柳树组织中敌敌畏的适宜条件为:温度40℃、压力34.48MPa、静态萃取时间20min、动态萃取CO2体积为20ml(1.0ml/min)、夹带剂甲醇(添加量0.15ml/g)、收集液丙酮。通过上述方法对柳树体内各组织中敌敌畏含量动态变化测定结果表明:敌敌畏经树干注药可在柳树体内经木质部长距离传导,分布于树体各组织中。树干注药后不同时间,敌敌畏在柳树树冠内不同部位的传导、分布存在较大差异。药剂进入木质部后,首先沿注药孔上方输导组织随蒸腾流纵向传导,进入注药孔上方的叶片中。树干注药24h时,树体各部位叶片内药剂含量差异最大,随着时间的延长,药剂在树体内逐渐降解,含量逐渐降低,各部位叶片内药剂含量差异也逐渐缩小,96h后在树冠各部位趋于均衡分布。树干注药初期叶片内药剂含量大于树体其他部位,随时间的延长,含量逐渐下降。注药7d后,药剂在树体各部位趋于均匀分布。