T细胞抗原表位研究方法的进展

表位(epitope)又称抗原决定簇(antigenic determinant),是指存在于抗原分子表面的能够决定抗原特异性的数个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构。根据与抗原受体结合不同分为B细胞(识别)表位和T细胞(识别)表位。 T细胞表位就是抗原蛋白中经抗原提呈细胞(antigenprocessing cell,APC)处理,由MHC分子提呈给T淋巴细胞受体的多肽片段。确定T细胞表位,对于研究细胞免疫的机理、过程及研制亚单位多肽疫苗和基因疫苗具有重要的意义。目     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白抗体的iELISA检测方法.以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,并确定检测临界值.经优化后,多表位抗原肽的最佳包被量为...     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

一株25型蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体识别表位的鉴定

为研究本实验室制备的一株抗25型蓝舌病病毒(BTV-25)VP7蛋白单克隆抗体(MAb)3H7识别的B细胞抗原表位,本研究利用噬菌体展示技术对3H7识别的抗原表位进行鉴定。经过3轮淘选后进行测序,测序结果经分析比对后获得共同的短肽序列为QYHAM;将该短肽序列合成后与3H7细胞上清和腹水均能够发生特异性反应;与BTV1~24型标准阳性血清的间接ELISA结果均呈现阳性反应;进一步的序列分析表明该表位的氨基酸序列QYHAM在不同血清型的BTV株间保守,确定该MAb识别的VP7抗原表位为238QYHAM242,本研究对于BT疫苗的设计及高通量检测试剂盒的研制均具有重要意义。     

多肽疫苗抗病毒作用研究进展

随着固相合成多肽及蛋白质序列测定方法的建立 ,通过对病毒三维结构及其免疫原性的研究 ,人们对病毒抗原表位已能较精确地分析及定位并人工合成这些抗原表位。肽类疫苗即是在此基础上发展起来的一种新型人工疫苗 ,它是以合成的一段免疫原性肽抗原配以适当的载体或 /和佐剂制成的疫苗。实验证明 ,这些抗原表位可诱生中和抗体或 /和病毒特异性的ＣＴＬ反应。第一个较为成功的多肽疫苗是 1963年Ａｎｄｅｒｅｒ用蛋白酶切割烟草花叶病毒时 ,获得的一短肽序列Ｔｈｒ＿Ｓｅｒ＿Ｇｌｕ＿Ｐｒｏ＿Ａｌａ＿Ｔｈｒ＿ＯＨ ,该多肽诱生的抗体能与完整的…     

病毒中和表位的图谱分析方法

测定病毒中和表位（亦称作Ｂ细胞表位）不仅可以推动亚单位疫苗的研制和病毒特异性血清学检测、诊断的发展,而且有助于阐明抗体与病毒的分子间识别机理。人工合成肽技术和基因克隆技术的发展与应用为表位测定方法开辟了崭新的道路。本文就目前所用的表位测定方法进行一次比较和总结。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。     

通用型辅助性T细胞表位增强了猪瘟病毒合成肽抗原的免疫原性

为了探讨通用型辅助性T细胞表位对猪瘟病毒人工合成短肽抗原免疫原性的影响,本研究合成了含有猪瘟病毒E2蛋白线性中和表位的短肽B,合成了含有通用型辅助性T细胞表位的短肽Th-B。同时,为了探讨免疫刺激基序对人工合成短肽抗原免疫原性的影响,合成了含有免疫刺激序列的IS-Th-B。将上述3种合成肽与弗氏佐剂混合乳化后,免疫兔子,比较3种不同的抗原肽诱导的抗体水平,并用猪瘟弱毒对免疫兔子进行攻击,比较抗原肽的免疫保护效果。结果显示,Th-B和IS-Th-B诱导了相当的抗体水平,但显著高于抗原肽B诱导的抗体水平。Th-B和IS-Th-B免疫延迟但没有阻止兔定型热的产生,而抗原肽B免疫兔和未免疫兔一样发生了明显的定型热反应。本研究表明,免疫刺激基序对本研究中的短肽诱导的抗体应答没有产生明显影响,但通用型辅助性T细胞表位增强了短肽抗原的免疫原性。     

RHDV VP60“通用型”T细胞表位预测

兔病毒性出血症核衣壳蛋白VP60是兔出血症病毒的主要结构蛋白,具有很强的抗原性和免疫原性,可诱导细胞免疫,在抗病毒免疫中起着关键作用.确定T细胞所识别抗原分子上的短肽序列对T细胞表位进行定位,对于研究特异性免疫应答有着重要意义.本研究应用T细胞抗原表位分析的研究方法,预测VP60T细胞蛋白质抗原表位,为后期试验奠定了基础.     

弓形虫多表位PLGA纳米疫苗的研究

构建弓形虫多表位PLGA纳米疫苗并评估其可行性,预测弓形虫TgMIC3蛋白的B、T淋巴细胞优势抗原表位,联合抗原表位SAG1₍(238-256))、GRA7₍(20-28))和AS15,构建出新型多表位肽,用生物信息学工具对其理化性质、三级结构和分子对接能力等特征进行分析;原核表达并纯化多表位重组蛋白(multi-epitope protein, MEP),通过Western blot鉴定纯化效果;搭建MEP-PLGA纳米递送体系,对纳米颗粒进行表征。结果表明,多表位肽为亲水性蛋白非过敏原,具有一定抗原性,抗原表位均呈现在蛋白表面,能与MHC分子H-2-Dd稳定结合;可在BL21(DE3)大肠埃希氏菌表达系统中稳定表达,并能被特异性抗体所识别;构建的MEP-PLGA纳米递送体系包封为54.42%,纳米颗粒饱满,大小均一。成功设计并构建出弓形虫多表位PLGA纳米疫苗,为弓形虫新型纳米疫苗的研发奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒P72蛋白合成肽疫苗的构建及其免疫效力评估

【目的】构建非洲猪瘟病毒CAS19-01/2019株(GenBank登录号:MN172368.1)结构蛋白P72的合成肽疫苗,通过免疫小鼠评估合成肽疫苗的免疫效力。【方法】利用ProtParam、SOPMA等软件分析P72蛋白的理化性质与结构信息,通过ABCpred、SVMtrip、IEDB预测P72蛋白的T细胞与B细胞抗原表位,筛选出显著的表位多肽区域,合成多肽辅以弗氏佐剂腹腔注射免疫小鼠,检测免疫组小鼠产生的特异性抗体、T淋巴细胞亚群、脾脏淋巴细胞增殖、细胞因子白介素4(IL-4)、IL-2、γ干扰素(IFN-γ)、免疫球蛋白(IgG),从体液免疫与细胞免疫角度评估合成肽的免疫效力。【结果】综合分析得出P72蛋白是稳定性亲水蛋白,二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲分别占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。筛选出了P72蛋白的8个优势抗原表位,626－634、520－528、298－306、203－211位氨基酸处为T细胞抗原表位,587－606、232－251、110－129、39－58位氨基酸处为B细胞抗原表位。整合优势表位合成2个多肽P72-1与P72-2,首次免疫小鼠14 d时可检测到P72-1与P72-2的特异性抗体,首免后28 d达到最高值,其最高抗体效价分别为1∶25 600与1∶12 800;免疫后小鼠T淋巴细胞亚群CD4^＋/CD8^＋显著上升(P＜0.05);脾脏淋巴细胞增殖试验结果显示,免疫组淋巴细胞数量均极显著升高(P＜0.01);细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ含量均极显著增加(P＜0.01)。【结论】本研究成功研制2种合成肽疫苗,在免疫效力上P72-2高于P72-1,二者都能产生高水平的特异性抗体,刺激脾脏淋巴细胞增殖,诱导产生细胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ,本研究为非洲猪瘟合成肽疫苗研制奠定技术基础。     

大肠杆菌O157∶H7 Ivy蛋白表位多肽及免疫原性分析

为评价合成的O157∶H7Ivy146—157多肽作为疫苗抗原的可行性,本试验利用生物信息学方法分析Ivy的二级结构、氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、表面可及性和抗原指数,筛选获得1条含有B细胞抗原表位的多肽序列Ivy146—157,进行化学合成。多肽免疫BALB/c小鼠,测定免疫后小鼠的抗体水平及Ivy146—157多肽对小鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况。结果显示,合成的Ivy146—157多肽第3次免疫小鼠后抗体水平达到1∶6 400,制备的Ivy146—157多克隆抗体能够识别天然菌株中的目的蛋白;MTT试验结果显示,Ivy146—157免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖明显,与对照组差异显著(P0.05)。结果表明,Ivy146—157多肽能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。     

噬菌体展示技术原理及其在生物学研究中的应用

噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性多肽的技术,通过将编码多肽的基因片段与编码噬菌体表面蛋白的基因融合进而以融合蛋白形式表达于噬菌体表面.该技术被广泛用于研究蛋白质的结构与功能、蛋白质间的识别与相互作用、抗原表位筛选及疫苗的研制等,并产生了深远的影响.文章简要介绍了噬菌体展示技术原理、随机肽库生物淘洗过程及该技术在病毒学和新型疫苗研究中的应用.     

南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原表位的筛选及抗原性分析

目前,我国南非Ⅱ型(SATⅡ)口蹄疫病毒(FMDV)的防控形势十分严峻,为了防止SATⅡ型FMD的跨境传入,迫切需要建立其特异的检测方法。本研究以SATⅡ型FMDV结构蛋白氨基酸序列为依据,利用分子生物学软件分析了FMDV结构蛋白VP1~VP3上可能的抗原表位,并人工合成了8条表位多肽。通过采用SATⅡ型FM-DV阳性血清进行ELISA反应,检测其反应原性;通过采用与载体蛋白偶联的合成肽免疫小鼠,测定小鼠血清中抗体效价,检测合成肽的免疫原性。结果表明,合成的8条多肽均能与SATⅡ型FMDV阳性血清结合,其中的6条多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体。本研究为利用串联表位为抗原检测SATⅡ型FMDV抗体方法的建立奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选与鉴定

筛选日本乙型脑炎病毒（JEV）的E抗原表位,为开展用JEV模拟表位探索JEV的防治研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据。以抗JEvE蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体7肽库,挑取噬菌体单克隆培养并ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEVE抗原模拟表位的氨基酸序列。设计合成包含该表位的E抗原15肽（GGADSMSMAGMAVSY）cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达载体,诱导表达重组多肽并west-ernblot验证。经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性。对重组多肽进行Western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多抗。应用上述方法成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为下一步研究奠定了基础。     

基于活性肽Ii-Key与异种病毒抗原表位的疫苗设计及其免疫效应

跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要参与主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子与抗原肽复合物的装配,其关键活性基团（Ii-Key）在此过程中发挥重要作用。为了研究Ii-Key携带异种病毒抗原表位能否有效增强机体的免疫应答,本试验首先构建Ii-Key与鸡传染性法氏囊病病毒VP2肽表位（aa197-209）和新城疫病毒HN肽表位（aa345-353）的嵌合体,并将嵌合体基因插入pET-32α原核表达载体,转化E.coli Rosetta诱导表达,用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,免疫SPF级BALB/c小鼠,分别通过间接酶联免疫吸附试验和免疫印记试验检测小鼠体内的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明,与VP2/HN串联表位对照组相比较,Ii-Key/VP2/HN嵌合体疫苗处理组抗体效价平均提高了13.7倍。通过将嵌合体基因导入pmCherry-C1真核表达载体与pEGFP-N1-MHCⅡα共转染293T细胞,结果表明Ii-Key/VP2/HN嵌合体与VP2/HN和空载体蛋白在细胞内均呈现弥散状,与MHCⅡ类分子共定位无明显差异。综上所述,Ii-Key能够携带异种病毒串联抗原表位有效增强免疫应答,其增强机制还有待于进一步研究。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的研究

蛋白质抗原表位 (抗原决定簇 )是蛋白质抗原性的物质基础 ,一个蛋白质分子可带有多个不同的抗原决定簇 ,即抗原表位 (epitopes)。通常 ,抗原表位是指氨基酸序列已经清楚的抗原决定簇。蛋白质抗原表位的研究 ,对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。B细胞蛋白抗原表位的预测自从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来 ,已有许多参数、算法发表 [1～10],对B细胞蛋白抗原表位研究起到了巨大的推动作用。本文就猪瘟病毒(SFV)E2蛋白抗原表位的研究概况作一介绍。1猪瘟病毒E2抗…     

鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定及其表位交叉反应性分析

为鉴定鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白的抗原表位,本研究以纯化的抗DTMUV E蛋白单克隆抗体(MAb)3B6为固相筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行淘选,通过对阳性噬菌体克隆测序分析,确定DTMUV E蛋白的模拟表位氨基酸序列,将模拟表位序列与GST蛋白融合表达并进行western blot验证。利用DNAStar对表位序列进行同源性分析,并通过dot blotting方法分析抗原表位在黄病毒阳性血清间的交叉反应性。结果鉴定了DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位EVEPPFG,并且该表位在DTMUV与其它黄病毒中均具有高度的保守性。Dot blotting结果显示抗原表位EVEPPFG在黄病毒阳性血清间具有交叉反应性。因此,EVEPPFG为黄病毒共享型的抗原表位,这对于黄病毒E蛋白的抗原结构功能的研究以及研制表位疫苗和诊断抗原等具有重要意义。     

1株鸭源新城疫病毒HN蛋白潜在抗原表位的分析

为了比较鸭源新城疫病毒(NDV)XZ株的HN蛋白的抗原表位与La Sota疫苗株间的差异,试验采用可塑性、亲水性、表面可能性、抗原性、二级结构等5项参数指标来综合预测鸭源NDV XZ株与疫苗株La Sota株HN蛋白的潜在B细胞抗原表位。结果表明:鸭源NDV XZ株HN蛋白预测抗原表位有26个,La Sota株HN蛋白预测抗原表位有25个。与La Sota株HN蛋白相比,多出2个抗原表位,缺失1个抗原表位。这3个表位的变化可能会对病毒识别细胞膜上的唾液酸受体及机体的免疫应答造成影响。两者HN蛋白都只有1个跨膜区域,位置接近。说明鸭源NDV XZ株HN蛋白与La Sota株HN蛋白相比,可能具有相近的抗原性,还需要进一步验证。