棉花EXO70基因家族全基因组的鉴定及种间比较

【目的】当前四倍体棉花的主栽品种是陆地棉与海岛棉，陆地棉产量高且适应性好，海岛棉纤维品质优异但产量一般。EXO70是胞外分泌体（exocyst complex）中的关键亚基，在植物生长发育、胁迫响应等方面发挥重要作用。通过全基因组水平鉴定和分析陆地棉与海岛棉EXO70基因家族成员，并研究其在纤维发育、环境适应等方面的功能，有助于揭示陆地棉与海岛棉种间性状差异形成的分子基础。【方法】从拟南芥数据库（TAIR）获取EXO70家族蛋白序列作为参考序列，采用HMMER、ExPASy、MEME、TBtools等分析工具对陆地棉TM-1和海岛棉Hai7124基因组中EXO70家族成员进行鉴定与分析，系统比较该家族在基因表达模式、重要农艺性状的相关性、逆境响应等方面的异同点。【结果】通过对陆地棉和海岛棉的基因组水平分析，均鉴定出54个EXO70家族成员，根据系统进化发育可将其分为8个分支。陆地棉和海岛棉同源基因可一一对应，分布在陆地棉与海岛棉的20条染色体上，绝大多数成员为单外显子，但是两者间有12对同源基因在阅读框序列上存在较大差异。陆地棉与海岛棉大部分同源基因表达模式类似，但在同一纤维发育时期表...     

棉花FT基因的特征和表达分析

利用生物信息学方法对13个棉种(二倍体棉8个、四倍体棉5个)的FT基因进行鉴定,并对其序列特征、进化关系、基因结构、蛋白结构、顺式作用元件进行分析;以陆地棉TM-1为试验材料,予以3种不同的光周期处理,利用qRT-PCR技术对陆地棉中的FT基因(GhFT基因)的时空表达特征进行定量验证.结果表明,13个棉种共获得18个...     

板栗GA20-氧化酶基因的克隆及序列分析

GA20-氧化酶(GA20-ox)是赤霉素生物合成中的限速酶,它能够催化从GA12到GA9及GA53到GA20过程中的3步氧化反应。笔者以板栗(Castanea mollissimaBlume)为材料,应用基因组步移技术克隆GA20-ox基因,获得长度为2 315 bp DNA序列,其中含有一个GA20-ox基因的全长编码区序列,命名为CmGA20ox1。Cm-GA20ox1长度为1 140 bp,且编码区内存在2个内含子,其推定蛋白CmGA20ox1序列长度为379个氨基酸,氨基酸序列比对分析显示CmGA20ox1与山毛榉坚果的FsGA20ox1(AJ420192)相似性为91.03%,系统发育树分析显示CmGA20ox1与山毛榉坚果FsGA20ox1(AJ420192)遗传距离最近。     

棉花染色体工程育种

用染色体工程技术将G染色体组的野生二倍体比克氏棉种与A染色体组的栽培二倍体亚洲棉种合成 [AG]复合染色体组亚比棉 ,再与 [AD]复合染色体组的陆地棉种、海岛棉种组合成 [A、D、G]三个染色体组的异源四倍体 ,拓宽了棉属遗传资源 ,为选育具有突破性状的棉花新品种创造培育出了新种质 ,并探索出棉属种间基因转育的创新技术。     

‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)中分离赤霉素合成关键酶基因GA2ox,并进行亚细胞定位及表达分析,为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料,通过改良的CTAB法提取总RNA,利用简并引物克隆GA2ox家族中2个基因的片段,采用3′和5′RACE方法得到基因的全长c DNA序列,分别命名为Dk GA2ox1和Dk GA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征,利用GFP进行亚细胞定位,实时荧光定量RT-PCR技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、生理落果期、果实着色期、果实成熟期中的表达特性。【结果】生物信息学分析Dk GA2ox1和Dk GA2ox2全长c DNA序列分别为1 318 bp和1 267 bp,分别含有198 bp和61 bp的5′非翻译区及97 bp和172 bp的3′非翻译区。编码332个和334个氨基酸,与毛白杨(JX102472.1)、夹竹桃(AY594292.1)、烟草(AB125232.1)、矮牵牛(GU059939.1)、苹果(FJ571521.1)、梨(JF441168.1)、葡萄(JQ608472.1)的相似度达73%—77%。含有保守20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白结构域,高度保守的2-酮戊二酸结合位点(Dk GA2ox1:Arg-272、Ser-274;Dk GA2ox2:Arg-271、Ser-273)和Fe2+结合位点(Dk GA2ox1:His-205、Asp-207、His-262;Dk GA2ox2:His-204、Asp-206、His-261),有赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2编码蛋白分子量分别为36 596.1 Da和37 544.2 Da,均为稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,无明显疏水区,属于C19-GAoxs。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,Dk GA2ox1编码蛋白定位于细胞核和细胞质中。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2在开花期表达最丰富,并在7个典型物候期中均高于乔化品种‘大方柿’。【结论】南通小方柿中赤霉素2-氧化酶基因的表达与其矮生性状有关。     

棉花基因组数据库中CPS&KS基因的查找与分析

为了探究赤霉素合成关键酶CPSKS类基因在棉花中的分布情况,分析了已发表的拟南芥CPSKS基因编码的蛋白质氨基酸序列,发现该类基因存在2个保守结构域,Terpene_synth和Terpene_synth_C,其在Pfam数据库中的种子文件分别为PF01397和PF03936。利用软件HMMER中的Hmmsearch程序在雷蒙德氏棉蛋白质数据库中调取72条序列,通过与拟南芥中的CPSKS基因序列进行比对,最终在雷蒙德氏棉基因组中筛选到5个CPSKS候选基因,这5个基因与四倍体棉花TM-1基因组At和Dt亚组的10个基因具有同源关系。通过对赤霉素敏感的棉花超矮杆突变体赤霉素处理前后转录组数据库分析比对,最终确定2个KS候选基因在转录组中表现为上调作用。     

应用RAPD-PCR分析棉花A基因组的起源与进化

应用RAPD -PCR技术对 2 1份棉花材料进行了遗传多样性分析。结果表明 :中棉、草棉与海岛棉、陆地棉 4个栽培种间的平均遗传距离分别为 0 .43 17、0 .3 946、0 .4193、0 .43 18;海岛棉与草棉的A染色体组较接近 ,而陆地棉与中棉的A染色体组相近 ,反映了异源四倍体与二倍体A基因组的进化关系。表明利用RAPD标记 ,通过遗传距离和聚类分析可以阐明棉花种质的亲缘关系。     

柱型与普通型苹果茎尖组织中 GA2ox基因的序列比较及表达量分析

以柱型苹果舞姿和普通型苹果富士茎尖为试材,克隆赤霉素合成代谢途径中的关键酶基因GA2ox,并对二者茎尖组织中GA2ox基因进行序列比较和表达分析。结果表明,两品种中GA2ox基因cDNA序列长度均为1 014bp,编码337个氨基酸。cDNA序列中存在2处单核苷酸差异,其中1处差异会引起编码氨基酸的改变。与已发表的苹果基因组中同源序列的比较分析表明,舞姿和富士cDNA序列上的差异不是造成柱型性状的原因。同时,利用实时荧光定量PCR方法,对两品种及其杂交F1代杂种的检测表明,柱型苹果茎尖中GA2ox基因的表达量明显低于普通型苹果。     

棉花蔗糖转化酶基因家族的生物信息学分析

为更好地了解蔗糖转化酶在棉花基因组中的数量和分布情况等,本研究利用拟南芥中17个蔗糖转化酶家族的基因为参考序列,在海岛棉、陆地棉、雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组数据库中鉴定到的蔗糖转化酶基因家族成员分别为65、46、26和25个,结果表明,海岛棉所含有的蔗糖转化酶基因明显多于陆地棉,而雷蒙德氏棉比亚洲棉仅多了1个。通过基因结构分析发现,酸性蔗糖转化酶和中性/碱性蔗糖转化酶α亚族大都包含6或7个外显子,而β亚族大多含有4或5个外显子。此外,部分海岛棉与雷蒙德氏棉在基因结构上存在着较长的UTR区,而陆地棉与亚洲棉可能没有;酸性蔗糖转化酶家族基因所编码的氨基酸序列大都包含3个保守基序,分别为DNPNG、FRDP和WECPD,表明不同种属中同一基因家族的进化保守性;由聚类分析推测,VIN亚族基因功能可能与棉花纤维发育相关。     

板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因比较分析

为探明芽变雄花序赤霉素含量降低的分子机制,对板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因古巴焦磷酸合成酶(CPS)、贝壳杉烯合成酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)、赤霉素20-氧化酶1(GA20ox1)和赤霉素3-氧化酶1(GA3ox1)的cDNA序列,以及KO基因DNA序列进行了比对,结果表明:两类花序中KO基因在开放阅读框的872、1 115和1 150bp存在3处碱基差异,分别造成了氨基酸由Glu、Tyr和Tyr突变为Gly、Phe和His,最终导致了跨膜区的改变,且发现cDNA上碱基突变是由DNA的碱基差异造成的。推测KO基因的这种突变导致板栗短雄花序性状。     

葡萄赤霉素合成相关基因克隆、亚细胞定位和表达分析

【目的】分离和克隆‘藤稔’葡萄内根-贝壳杉烯氧化酶基因（VvKO）、GA2-氧化酶基因（VvGA2ox2和VvGA2ox4）、GA3β-羟化酶基因（VvGA3ox4）和GA20-氧化酶基因（VvGA20ox1）等5个重要赤霉素合成相关基因的ORF序列,并对其进行亚细胞定位与表达分析。【方法】采用电子克隆方法克隆相关基因,构建亚细胞定位表达载体,基因枪转化洋葱表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察。并用半定量和荧光定量RT-PCR方法研究各基因的时空表达。【结果】成功克隆了5个基因的完整ORF序列,对上述基因在葡萄不同组织器官中的表达水平进行分析发现,它们在组织器官间的表达有强弱差异。其中,VvGA2ox2主要在果实中表达,VvGA2ox4主要在叶片和果实中表达,而VvKO、VvGA3ox4和VvGA20ox1则在花、叶片和果实中均有一定的表达。VvKO、VvGA2ox2、VvGA2ox4和VvGA3ox4与GFP融合蛋白仅在核内产生绿色荧光;而VvGA20ox1与GFP融合蛋白在细胞核和细胞质膜上均产生绿色荧光信号。【结论】克隆的5个基因与葡萄的花、果实以及营养器官的发育存在不同程度的联系,其中4个基因仅呈现出细胞核内作用的特点,而VvGA20ox1则表现出细胞核和细胞质膜定位的现象。     

棉属多倍化研究进展

多倍化在许多植物的物种形成及其随后的进化过程中发挥了关键作用。棉花是一个大属,一些棉种的起源发生过多倍体化,部分二倍体种是染色体二倍化的多倍体,比克氏棉最典型,拟似棉最复杂,还有D基因组的旱地棉和B基因组的3个种。陆地棉等5个异源四倍体种是多倍体化典型,是由A与D基因组近似的祖先种经过杂交和染色体加倍的双二倍体。它们的D亚组供体亲本种,前人认同的是雷蒙德氏棉,然而近期荧光原位杂交和叶绿体基因组学研究,提出了雷蒙德氏棉可能不是陆地棉亲本种的观点。四倍体棉种形成的多倍体化过程有多种推论,较为共识的时期是中更新世,结合近期包括叶绿体在内的基因组学的研究支持中更新世或更后些时候。荧光原位杂交、包括叶绿体在内的基因组学将为棉花多倍化分析提供更多的证据。     

陆地棉GhSAMDC基因家族的全基因组分析

以已报道的SAMDC为探针序列,从异源四倍体陆地棉基因组数据库中筛选获得14个GhSAMDC家族基因。GhSAMDC家族基因的氨基酸多重序列比对发现该家族成员序列相似性约为50%,家族成员均具有GhSAMDC家族特有的保守结构域:酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。染色体定位分析发现14个基因均匀地分布在A和D基因组,A和D上各含7个GhSAMDC成员,无家族成员构成基因簇的现象。转录组测序结果发现 GhSAMDC1、 GhSAMDC7和 GhSAMDC8对黄萎病菌的胁迫有明显的响应,暗示这些在棉花抵御黄萎病菌胁迫过程中发挥一定的作用。试验为进一步研究GhSAMDC家族基因的功能及解析棉花抗黄萎病分子机制奠定了一定基础。     

亚比棉及其与陆地棉、海岛棉种间杂交种的核型及似近系数聚类分析

为将原产澳洲的棉属野生种比克氏棉(Gossypium bickii)具有的子叶腺体延缓形成基因导入栽培种,将亚洲棉(G.arboreum)与比克氏棉(G.bickii)杂交,并经染色体加倍,获得亚比棉异源四倍体,然后再用异源四倍体与陆地棉(G.hirsutum)、海岛棉(G.barbadense)杂交获得具有[ADG]3个染色体组的三种杂种。本研究以三种杂种与其亲本为材料,对参试材料进行核型分析,并采用核型似近系数聚类分析方法对参试材料进行聚类分析。研究结果表明:亚比棉染色体的相对长度小于亚洲棉和比克氏棉,且变异范围较小,亚比棉的LC/SC值高于亲本亚洲棉和比克氏棉;亚比棉×陆地棉和亚比棉×海岛棉的LC/SC值比任一亲本均高。亚比棉的臂比均值最小,核型最为对称,为1A。核型聚类结果表明,陆地棉和海岛棉的核型似近系数最大为0.995 8,核型进化距离为0.004 2,亲缘关系最近。比克氏棉和亚比棉的核型似近系数最小为0.648 3,核型进化距离为0.433 4,亲缘关系最远。     

陆地棉PHYB基因生物信息学分析

[目的]对陆地棉PHYB基因有一个全面的认识和生物信息学分析.[方法]在陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共鉴定获得2个PHYB基因,这2个基因分别分布在A10和D10亚基因组.利用生物信息学方法对这两个基因进行初步分析.[结果]棉花的PHYB具有其他植物PHYB相同的基序和结构域,不管是数目还是分部位置都比较一致;不同植物的PHYB氨基酸序列同源性比对及构建的进化树都显示棉花的PHYB同可可的在同源性和进化关系上都是最高的,同水稻、玉米等单子叶植物的同源性及进化关系较低;基因结构的比对结果同样显示植物PHYB基因在进化上比较保守;棉花PHYB存在几十个可能磷酸化的位点,这些位点的磷酸化作用可能影响光敏色素的功能及其介导的信号通路.[结论]该研究结果为陆地棉PHYB基因的克隆和功能研究提供了理论基础.     

陆地棉扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。     

拟南芥GA20氧化酶家族的生物信息学分析

采用生物信息学的方法对拟南芥中多个GA20氧化酶(GA20ox)氨基酸序列的理化性质、亚细胞定位、进化关系、基序和磷酸化修饰位点进行了预测和分析.结果表明,拟南芥中的GA20ox可被划分为2个亚类,1个亚类被预测定位于细胞质,另1个亚类被预测定位于叶绿体.     

苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的克隆及功能分析

【目的】从‘苏帅’苹果(Malus domestica)中分离克隆赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框(ORF),分析其序列特征及在苹果中的组织表达特异性,通过在烟草中过表达MdGA2ox8研究其对烟草生长发育的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR方法从苹果中克隆出MdGA2ox8的ORF区。利用NCBI、DNAMAN和Pfam在线软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MdGA2ox8氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;利用SignalP和TMHMM Server V.2.0分别在线分析蛋白质的信号肽和预测蛋白质的跨膜结构域;利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达量。构建MdGA2ox8过表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化技术将MdGA2ox8导入烟草中,获得具有潮霉素抗性的转基因烟草植株,通过GUS染色、基因组PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性植株;将野生型和转基因烟草移栽后,在第一朵花开放时测定转基因烟草的株高、节间长度和叶片长宽比以及烟草叶片叶绿素含量,激素GA1和GA4含量,并通过RT-qPCR方法分析烟草中相关基因的表达水平。【结果】成功克隆并获得了长为1 122 bp的MdGA2ox8 ORF区,编码373个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为42.8 kD,理论等电点为5.44,不稳定系数为49.73,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽,为非分泌蛋白。序列系统进化分析结果显示MdGA2ox8与白梨GA2ox8亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,MdGA2ox8在苹果各组织中差异表达,在花中的表达量最高,其次为老叶幼叶韧皮部,在木质部和幼果中几乎不表达。将MdGA2ox8转入模式植物烟草中,获得了5个转基因阳性株系。与野生型相比,过表达MdGA2ox8烟草植株GA4含量降低,GA1含量有所升高,其中野生型和转基因烟草GA1平均含量分别为1.26和1.75 ng·g-1,GA4平均含量分别为5.43和1.07 ng·g-1。与野生型相比,转基因烟草植株GA1和GA4总含量降低,使植株节间缩短、矮化以及花期推迟,其中野生型和转基因烟草植株平均高度分别为38.50和7.36 cm,节间长度分别为9.5和3.3 cm;转基因烟草叶片颜色深绿,叶片长宽比降低。烟草内源赤霉素合成途径相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达水平受MdGA2ox8的正反馈调节。【结论】获得苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框,MdGA2ox8具有组织表达差异性。MdGA2ox8过表达烟草植株中GA1和GA4总含量降低,导致植株节间长度缩短、植株矮化。     

陆地棉PHYB基因生物信息学分析（英文）

[目的]对陆地棉PHYB基因有一个全面的认识和生物信息学分析。[方法]在陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共鉴定获得2个PHYB基因,这2个基因分别分布在A10和D10亚基因组。利用生物信息学方法对这两个基因进行初步分析。[结果]棉花的PHYB具有其他植物PHYB相同的基序和结构域,不管是数目还是分部位置都比较一致;不同植物的PHYB氨基酸序列同源性比对及构建的进化树都显示棉花的PHYB同可可的在同源性和进化关系上都是最高的,同水稻、玉米等单子叶植物的同源性及进化关系较低;基因结构的比对结果同样显示植物PHYB基因在进化上比较保守;棉花PHYB存在几十个可能磷酸化的位点,这些位点的磷酸化作用可能影响光敏色素的功能及其介导的信号通路。[结论]该研究结果为陆地棉PHYB基因的克隆和功能研究提供了理论基础。