FOXO基因对印楝素诱导sf9细胞凋亡的影响

【目的】探讨印楝素（azadirachtin, AZA）通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA 对sf9 细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot 检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况; RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白 Bim和 Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。     

大黄素对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

研究大黄素对人肺癌A549细胞的药效及其诱导细胞凋亡的分子机制。通过MTT法检测大黄素对A549细胞的杀伤作用;通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术检测大黄素对A549细胞的凋亡作用;通过免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达量变化。大黄素对A549细胞具有良好的杀伤作用且呈浓度依赖性;荧光显微镜和流式细胞术检测发现大黄素能够诱导A549细胞的凋亡且呈时间依赖性;Western blot检测显示大黄素处理A549细胞后,p-AKT、Bcl-2的表达量明显减少,Bad和cleaved-caspase-3的表达水平明显增加。大黄素通过调控AKT信号传导途径诱导人肺癌A549细胞的凋亡。     

丁香酚诱导癌相关成纤维细胞凋亡的研究

【目的】研究丁香酚诱导癌相关成纤维细胞（CAF）的凋亡表现及其相关机制,为丁香酚的开发利用提供参考。【方法】用0（CK）,30,60,90,120 μmol/L丁香酚处理正常成纤维细胞(NF)24 h后,用MTT法检测细胞活力。用0（CK）,30,60,90,120,150,180 μmol/L丁香酚处理CAF细胞24 h后,用MTT法检测细胞活力。用0（CK）,30,60 μmol/L丁香酚处理CAF细胞24 h,用Annexin V FITC和PI双染色法对细胞染色后进行流式细胞分析。用60 μmol/L丁香酚处理CAF细胞0（CK）,15,30,60,120 min,用Western blotting法检测凋亡相关蛋白表达水平的变化。【结果】30~120 μmol/L丁香酚处理对NF细胞活力无显著影响;30~180 μmol/L丁香酚处理对CAF细胞活力有显著或极显著的抑制作用,丁香酚对CAF细胞的半数抑制浓度为84.47 μmol/L。60 μmol/L丁香酚能够显著诱导CAF细胞凋亡。凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P-P53、Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cytochrome C参与了丁香酚诱导的CAF细胞凋亡调控过程。【结论】丁香酚对CAF细胞有抑制作用,其作用可能是通过P53蛋白途径和内源性凋亡途径实现的。     

流感病毒在诱导A549细胞凋亡过程中对SIRT1和P53蛋白的影响

采用流式细胞术观察了流感病毒诱导A549细胞凋亡的情况,同时应用Western blot方法研究了SIRT1和p53等蛋白的表达情况。结果表明:1000 TCID50/mL剂量流感病毒感染A549细胞后,细胞表现出典型的凋亡特征,且凋亡比例随感染时间延长而逐渐增加。在流感病毒诱导细胞凋亡过程中,SIRT1蛋白的表达下降,p-p53的表达上升。线粒体中Bax的表达上调,Bcl-2的表达下降。可见SIRT1蛋白参与了流感病毒诱导的A549细胞凋亡,SIRT1蛋白表达下调可能促进了Bax释放进入线粒体和p53蛋白功能的进一步发挥。     

淫羊藿苷对结肠癌增殖、侵袭抑制作用及机制研究

淫羊藿苷(Ica)梯度处理人结肠癌细胞HT29,采用MTT法、流式细胞术、Transwell小室检测Ica对HT29细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移的影响;蛋白组织学技术寻找Ica作用前后的差异蛋白, Western blot对部分蛋白进行验证。结果表明:Ica能够抑制HT29增殖;阻滞细胞由G_0/G_1期向S期的发展;诱导HT29细胞凋亡;抑制细胞侵袭和迁移; Ica干预24 h后,乙醛脱氢酶2 (ALDH2)和钙离子依赖性磷脂结合蛋白1 (CPNE1)上调, Western blot验证结果一致。这一研究提示Ica可显著抑制HT29细胞的增殖、侵袭和迁移,诱导细胞凋亡,其机制可能与上调ALDH2和CPNE1有关。     

Spiranthesphenanthrene A对人胃癌AGS细胞凋亡影响及其机制初步研究

为探讨从绶草中分离得到的新化合物spiranthesphenanthrene A对人胃癌AGS细胞凋亡的作用及可能机制,利用MTT法检测spiranthesphenanthrene A对AGS细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡情况; Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水平。结果表明:spiranthesphenanthrene A呈剂量和时间依赖性地抑制AGS细胞活力(P0.05);与空白对照组相比, spiranthesphenanthrene A可显著诱导AGS细胞凋亡,且呈剂量依赖性(P0.05)。进一步研究表明, spiranthesphenanthrene A可显著上调凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax和Cytochrome C (Cyt-C)的表达,并下调Bcl-2的表达(P0.05)。这一研究提示spiranthesphenanthrene A能抑制AGS细胞活力,并通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡。     

褪黑素对HT-2毒素诱导的牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响

[目的]本文旨在探讨HT-2毒素对牛卵巢颗粒细胞内质网应激与自噬的影响,并评估褪黑素(Mel)是否能减弱HT-2毒素对颗粒细胞的毒性作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞,使用0、5、25、50、75和100 nmol·L~(-1) HT-2毒素分别处理细胞24 h,或使用褪黑素(100μmol·L~(-1))预处理12 h后再用HT-2毒素(50 nmol·L~(-1))处理24 h。采用CCK-8检测细胞增殖,用细胞免疫荧光技术检测细胞自噬,用RT-qPCR分析内质网应激与自噬关键基因CHOP、GRP78、Atg7和p62 mRNA表达,用Western blot检测内质网应激和自噬相关蛋白的表达。[结果]与对照组相比,HT-2毒素可导致卵巢颗粒细胞的增殖并呈浓度依赖性减少。免疫荧光染色显示HT-2毒素诱导的细胞自噬呈浓度依赖性增加(P0.01)。内质网应激相关基因CHOP和GRP78 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性上调(P0.01),自噬相关基因Atg7 mRNA表达呈浓度依赖性增加(P0.01),p62 mRNA及蛋白表达呈浓度依赖性减少(P0.01)。褪黑素预处理显著减轻了HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬。[结论]HT-2毒素可诱导牛卵巢颗粒细胞的内质网应激和自噬并呈浓度依赖性增加,褪黑素可以缓解HT-2毒素诱导的内质网应激和自噬作用。     

凋亡素融合基因原核表达载体的构建及可溶性表达

在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-22b-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达。软件分析结果表明表达蛋白占菌体蛋白的20%,上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。     

microRNA-22对白血病K562细胞羟基脲化疗敏感性的影响

对人慢性髓性白血病K562细胞进行羟基脲处理后高通量测序发现microRNA-22 (miR-22)表达量变化显著,上调达3.4倍。单基因GSEA分析提示miR-22可能调控白血病细胞对药物的响应。构建可诱导表达miR-22的K562细胞系,运用活细胞计数、流式细胞术、Caspase 3活性检测、Western blot和联苯胺染色等方法检测miR-22对羟基脲处理后K562细胞存活率、周期、凋亡和分化的影响。结果表明：过表达miR-22可导致K562细胞发生G0/G1期阻滞,从而帮助细胞逃逸羟基脲在S期的杀伤作用;过表达miR-22可显著拮抗羟基脲介导的sub-G1期细胞增多、Caspase 3活性上调、cleaved PARP1表达上调等凋亡现象;过表达miR-22还可促进羟基脲介导的红系分化。这一研究提示在K562细胞中,miR-22既可拮抗羟基脲化疗所致的细胞杀伤性效应(增殖、凋亡),也可促进羟基脲化疗所致的非细胞杀伤性效应(分化)。     

二甲双胍抑制皮肤成纤维细胞活化的作用机制研究

为探讨二甲双胍抑制皮肤成纤维细胞活化的作用及机制,利用细胞实时分析检测系统检测二甲双胍对体外培养的皮肤成纤维细胞HFF-1增殖的影响,确定体外最适药物浓度;通过Real-time PCR检测二甲双胍对原代培养的硬皮病患者皮肤成纤维细胞中胶原及纤维化相关基因表达的影响,进一步检测二甲双胍对TGF-β诱导后的正常皮肤成纤维细胞HFF-1中纤维化相关基因表达的作用;通过Western blot检测二甲双胍对I型胶原蛋白表达的作用;通过Sircolassay检测二甲双胍对细胞上清中分泌的胶原蛋白的影响。结果表明:二甲双胍可抑制皮肤成纤维细胞增殖,且具有剂量依赖性;与对照组相比,二甲双胍可降低成纤维细胞中纤维化相关基因表达及细胞上清中胶原蛋白含量。此外,二甲双胍可显著下调TGF-β诱导的纤维化相关基因及胶原蛋白的表达。这一研究提示二甲双胍可能通过抑制成纤维细胞活化而抑制纤维化。     

弥罗松酚对B细胞淋巴瘤细胞株的作用研究

弥罗松酚梯度处理小鼠淋巴瘤细胞系38B9细胞后,采用CCK-8法测定细胞增殖活性;流式细胞术检测淋巴瘤细胞的凋亡率; Western blot检测Beclin1蛋白水平。建立B淋巴瘤小鼠模型并腹腔注射弥罗松酚,检测其对小鼠淋巴瘤的生长、凋亡的影响。结果表明:弥罗松酚对小鼠淋巴瘤细胞系38B9的生长有明显的抑制作用,且能显著促进细胞凋亡;弥罗松酚处理后, 38B9细胞Beclin1蛋白水平显著升高。这一研究提示弥罗松酚可显著抑制淋巴瘤的生长,同时诱导38B9细胞的凋亡,可能与弥罗松酚调控38B9细胞的自噬功能有关。     

p38MAPK通路激活内质网应激参与高糖诱导血管平滑肌细胞钙化

目的 探讨p38 MAPK通路是否通过激活内质网应激及凋亡参与高糖所致血管平滑肌细胞(vascular smooth muscular cell,VSMCs)钙化.方法 大鼠VSMCs分为对照组、高糖组(35 μmol/L D-葡萄糖)、内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)组、p38 MAPK通路抑制剂SB203580组、β-磷酸甘油组、4-PBA+高糖组、SB203580+高糖组、β-磷酸甘油+高糖组,分别用比色法、o-cresolphthalein法和Western blot测定碱性磷酸酶(ALP)活性、钙含量和骨分化转录因子(Runx2和Osterix)表达.结果 D-葡萄糖处理3、7 d上调VSMCs ALP活性、钙含量和骨分化标志蛋白表达;SB203580下调ALP活性、钙含量和骨分化转录因子表达,而4-PBA抑制高糖引起VSMCs内质网应激及凋亡.结论 p38 MAPK通路通过激活内质网应激和凋亡可能是高糖诱导VSMCs钙化的重要机制.     

热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞凋亡和雌激素合成

热应激严重影响动物的繁殖性能,但热应激是如何通过调控绵羊卵巢颗粒细胞功能进而调控绵羊繁殖的相关研究较少。本研究以湖羊卵巢颗粒细胞为研究对象,利用Real-time PCR、流式细胞技术、Western blot、ELISA等方法探讨热应激对湖羊卵巢颗粒细胞钙信号通路、细胞凋亡和雌激素合成的影响。结果表明,热应激后,湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子浓度显著上升(P<0.05),钙离子信号通路中相关基因CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2表达量显著升高,线粒体分裂蛋白FIS1表达量显著上升,促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表达量比值(BAX/BCL2)显著上升,细胞凋亡率增加;雌二醇合成关键酶CYP19A1表达量显著下调,雌二醇含量显著下降(P<0.05)。热应激卵巢颗粒细胞中加入钙离子螯合剂(BAPTA-AM)明显降低钙离子浓度,同时减少细胞凋亡,缓解热应激造成的卵巢颗粒细胞雌二醇含量下调。综上表明,热应激打开了湖羊卵巢颗粒细胞膜电压门控钙离子通道和内质网膜上钙离子释放通道,导致细胞质中钙离子浓度上升,促进卵巢颗粒细胞凋亡,引起雌二醇...     

线粒体途径参与FTY720诱导白血病细胞凋亡的研究

为研究FTY720诱导K562细胞凋亡与线粒体途径的关系。体外培养人白血病K562细胞,用不同浓度FTY720处理细胞24 h,台盼蓝染色法检测K562细胞存活率;流式细胞术分析细胞凋亡和线粒体功能。免疫印迹技术检测线粒体相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。收集FTY720处理48 h细胞,流式细胞技术检测细胞周期。结果表明:随FTY720浓度的增加,K562细胞的存活率下降,细胞凋亡增加,线粒体膜电位下降,促凋亡蛋白Bax表达明显增加。细胞周期分析发现,Sub G1期细胞增加,而S期和G2M期细胞减少。表明线粒体途径参与FTY720诱导K562细胞凋亡。     

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。     

线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素致PC12细胞凋亡中的作用

探讨线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素诱导PC12细胞凋亡中作用。取对数生长期PC12细胞,用含0、62.5、125、250μg.mL-1硫酸黏菌素DMEM培养液,作用24 h,采用Hoechst33258荧光染色法检测PC12细胞凋亡,Western blot法检测细胞色素C(Cyt-C)、Bax、Bcl-2蛋白表达含量,试剂盒检测Caspase-3活性。与对照组相比,125、250μg.mL-1硫酸黏菌素剂量组细胞PC12细胞Cyt-C、Bax蛋白表达量、Caspase-3活性显著升高(P<0.01);Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),具有剂量-效应关系。说明线粒体途径介导PC12细胞凋亡是硫酸黏菌素神经毒性作用机制之一。     

线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素致PC12细胞凋亡中的作用

探讨线粒体凋亡途径在硫酸黏菌素诱导PC12细胞凋亡中作用.取对数生长期PC12细胞,用含0、62.5、125、250 μg· mL-1硫酸黏菌素DMEM培养液,作用24 h,采用Hoechst33258荧光染色法检测PC12细胞凋亡,Western blot法检测细胞色素C(Cyt-C)、Bax、Bcl-2蛋白表达含量,试剂盒检测Caspase-3活性.与对照组相比,125、250 μg· mL-1硫酸黏菌素剂量组细胞PC12细胞Cyt-C、Bax蛋白表达量、Caspase-3活性显著升高(P＜0.01);Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.01),具有剂量-效应关系.说明线粒体途径介导PC12细胞凋亡是硫酸黏菌素神经毒性作用机制之一.     

Gefitinib对人结肠癌Caco-2细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨Gefitinib对人结肠癌Caco-2细胞增殖与凋亡的影响.方法 2.5～30μmol/L Gefitinib处理Caco-2细胞24～72 h,MTS、流式细胞术、免疫荧光、Western blot检测细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位、MAPK及凋亡相关蛋白表达.结果 Gefitinib呈浓度和时间依赖性抑制...     

白花败酱草醇提物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

【目的】研究白花败酱草醇提物对四氯化碳(CCl_4)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用,为白花败酱草醇提物的药用及作为保健野菜的开发利用提供参考。【方法】以40只洁净级昆明小鼠为研究对象,设空白对照组、模型组、白花败酱草醇提物低剂量组、中剂量组、高剂量组5个处理,用CCl_4腹腔注射诱导建立小鼠急性肝损伤模型,采用苏木精-伊红(HE)染色法对肝脏组织进行病理检测;采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色检测小鼠肝细胞凋亡情况;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测小鼠肝组织细胞凋亡相关蛋白的表达水平。【结果】白花败酱草醇提物能显著改善肝组织病变情况,显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性及肝匀浆中丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性,显著提高小鼠肝匀浆中超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽(GSH)含量。TUNEL染色结果显示,白花败酱草醇提物能显著抑制CCl_4诱导的肝细胞凋亡。与模型组相比,白花败酱草醇提物使CCl_4刺激的小鼠肝组织Bcl-2蛋白表达显著升高,Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2/Bax升高。【结论】白花败酱草醇提物通过抗氧化及抑制肝细胞凋亡而改善CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤。     

冷应激对东北野猪成纤维细胞周期和凋亡的影响

以猪成纤维细胞为研究对象,应用流式细胞术检测4、15、25和32℃不同强度冷应激条件下细胞周期和细胞凋亡情况。结果表明,在冷应激的低温处理过程中,细胞主要出现G0/G1期阻滞,随低温强度的增加而作用加强;低温培养诱导细胞凋亡,随低温强度的增加而作用加强,但在检测的2、4、6和8 h中,细胞凋亡率达到一定程度后,不再随低温处理时间延长而增加,细胞对低温产生耐受。复温培养过程中主要引起细胞G2/M期阻滞,随低温强度的增加而作用加强;细胞凋亡出现在复温培养的2~6 h,是延迟和渐进过程,与低温处理强度密切相关。