桑枝枯菌核病病菌拮抗芽孢杆菌的筛选和鉴定

为获得有效防治桑枝枯菌核病的生防菌,通过对峙培养法筛选对桑枝枯菌核病病菌具有抑制作用的拮抗菌株,获得6株抑制作用较强的芽孢杆菌,其菌丝抑制率在65.41%～91.41%之间。叶片离体试验结果显示,6个菌株均能较好地抑制病斑的发展,其防治效果在50.00%～85.71%之间,均高于化学药剂对照40%嘧霉胺可湿性粉剂的防治效果(47.62%),其中以NN05菌株的防治效果最好,达85.71%。胞外酶活性检测结果显示,6个拮抗菌株均能产生胞外蛋白酶,均不能产生几丁质酶;除了NN05菌株外,其他5个菌株均具有溶磷作用;还有3株菌株(NN01、NN04和NN05)可以产生β-1,3-葡聚糖酶,3株菌株(NN05、NN11和NN29)可以产生纤维素酶。经16S rDNA序列和gyrB基因序列分析,将NN01、NN04、NN05菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),NN11、NN25、NN29菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本研究结果可以为桑枝枯菌核病的生物防治提供菌种资源。     

牛奶中蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定

蜡样芽孢杆菌是乳制品中容易污染的一种致病菌。为了鉴定市售牛奶中是否含有蜡样芽孢杆菌,该研究通过生化和分子生物学鉴定方法对牛奶中蜡样芽孢杆菌进行了分离和鉴定。结果表明,市售牛乳中分离、鉴定了一株蜡样芽胞杆菌,这表明蜡样芽胞杆菌对牛奶产品具有较大的食品安全风险。     

水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌的多重PCR检测体系开发

本研究设计水稻细菌性条斑病菌和水稻白叶枯病菌的专化性引物,建立了可同时检测这两种细菌的多重PCR检测体系。通过体系优化、特异性和灵敏度检查,结果表明：两对专化性引物X-b和X-t具有较高的特异性和灵敏度,对水稻细菌性条斑病菌液和水稻白叶枯病菌液的检测灵敏度分别为104 cfu/mL和105 cfu/mL;利用本研究建立的多重PCR体系,成功地从50种市售水稻种子中检测出1个水稻品种带有水稻细菌性条斑病菌,1个水稻品种水稻白叶枯病菌。本研究建立了多重PCR检测体系,为检疫部门控制这两种检疫性种传病害的入侵提供了有效检测技术和手段。     

一株猪源致病性蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

无菌采集流行性腹泻耐过仔猪的肝脏样本,经无氧及有氧培养获得一株疑似蜡样芽孢杆菌的纯培养物,命名为HN1203。16SrDNA序列(GenBank登录号为JX294967)分析表明,HN1203为蜡样芽孢杆菌群第7基因型菌株。生化鉴定结果表明,该菌的生化特性符合蜡样芽孢杆菌群成员的特征。药敏试验和伴孢晶体蛋白检测结果表明,该菌对链霉素和四环素敏感,对青霉素不敏感,其芽孢不形成伴孢晶体。多位点序列分型(MLST)检测结果表明,该菌带有蜡样芽孢杆菌看家基因pta新的等位基因pta153,序列基因型为ST611。毒素基因的PCR检测结果表明,该菌携带肠毒素基因(hbl、nhe和entFM)和细胞毒素K基因(cytK)。综合以上结果,分离菌为一株新的蜡样芽孢杆菌,且提示分离培养蜡样芽孢杆菌时,不宜采用常用的有氧条件。进一步动物试验结果表明,该分离菌株能够致死实验小白鼠。提示生产实践中应该重视监控猪源致病性蜡样芽孢杆菌的潜在危害。     

水稻白叶枯病菌拮抗细菌B56菌株的拮抗活性研究

B56 菌株经30 ℃振荡培养去菌体,其上清液经2 m ol/L 硫酸铵沉淀获得对水稻白叶枯病菌有拮抗活性的初提液。该初提液具有耐热性,经一定强度热处理后仍保持强的抑菌能力;抑菌效果在pH3～9 之间无明显差异;用胰蛋白酶、蛋白酶K 等处理后拮抗活性无明显变化。利用PhenylSepharose CL-4B疏水色谱柱和DEAE-Sephacel阴离子交换柱分离B56 菌株初提液, 得到一个具有拮抗活性的洗脱峰。该洗脱峰经SDS-PAGE检测发现具有一条分子量约为36 kD 的蛋白带。质粒提取和检测发现B56菌株存在一个稳定的内源质粒。     

一株拮抗腐霉病菌的枯草芽孢杆菌的分离鉴定及诱变选育

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可产生多种抗菌蛋白、抗生素及酶类抗菌物质,对多种植物病原真菌有良好的防治效果。通过从土壤中分离抑真菌活性的枯草芽孢杆菌,并进行UV-NaNO2物理化学联合诱变,获得一株对腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)具有较强拮抗作用的菌株。突变菌株的生长速率、耐高温性均较出发菌株有较大提高,盆栽试验表明诱变菌株较出发菌株对腐霉病菌引发的黄瓜腐霉病具有更好的防治作用。     

淀粉质食品中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定

[目的]分离鉴定淀粉质食品中的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).[方法]以淀粉质食品(低温保藏的米饭)为原料,采用传统方法对米饭中蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定,使用PCR技术做最终确定.[结果]对低温保藏米饭进行系列稀释后在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上进行菌种分离,初步分离出菌株MF-2,表面光滑稍有光泽,呈现低凸起形,边缘呈现锯齿状,菌落形状可形成近似圆形、质地松软、无色素,菌落颜色为乳白色不透明;经革兰氏染色为阳性,镜检为杆状;经芽孢染色为有芽孢杆菌;MF-2号菌能利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖,并产酸,但不能分解D-甘露糖和α-乳糖,初步鉴定菌株MF-2为蜡样芽孢杆菌.由16S rRNA基因序列同源性分析,结合形态观察和生理生化鉴定,最终鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).[结论]研究可为食品质量安全提供理论和实践依据.     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola,Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）合成基因,avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae,Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点,把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上,获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上,获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105,把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99,通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现,lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示,基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关,前两基因的突变导致细菌完全失去毒性,而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型,在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此,本试验证明,以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

两株蜡样芽孢杆菌的鉴定及液体培养基筛选

通过对两株待试芽孢杆菌的卵磷脂酶等13个生理生化特征,4种氮源,12种碳源利用及动物毒理试验(小白鼠),鉴定出两株待试芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus,B.C).通过pH梯度,温度梯度,NaCl浓度梯度等试验,初步断定此三株菌最适生长条件为pH 7～8,温度37 ℃,NaCl 10 g/L;通过对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ 5种培养基的液体培养筛选和验证实验,初步断定培养基Ⅲ在保证菌数的前提下,最为廉价,芽孢率也最高,为最适生产用液体发酵培养基;通过动物毒性实验,02、03与09号菌株作为添加剂或药剂(菌数≤109·g-1)均安全无毒.     

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

从土壤中分离筛选到一株具有广谱抗菌活性的拮抗细菌,命名为XZ-1。采用平板对峙培养法测定其抑菌活性,结果显示:XZ-1对大蒜叶枯病菌、草莓炭疽病菌等8种重要农作物病害的病原真菌均具有较强的拮抗活性,且抑菌带直径均大于10 mm。采用PCR扩增16S r DNA片段并用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树,结果表明XZ-1与解淀粉芽孢杆菌16S r DNA序列KY828923聚为一簇,因此初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。采用单因素试验设计对XZ-1的生物学特性进行研究,结果表明:XZ-1在pH值为6时生长最佳,在氯化钠浓度为0¹0g/L之间时生长情况相对较好;对光暗不敏感,致死温度为100℃、10 min。     

1株烟草赤星病拮抗芽孢杆菌的鉴定与活性研究

【目的】筛选对烟草赤星病具有拮抗作用的芽孢杆菌并进行鉴定,同时研究其抗菌作用。【方法】从陕西、云南、湖北和河南4省烟区采集烟草根际土壤和烟叶,从中分离筛选烟草赤星病拮抗芽孢杆菌,并对拮抗性最强的1株芽孢杆菌进行形态学、生理生化特性、16S rDNA序列鉴定及粗提物抑菌作用测定。【结果】从烟草表面及根际土壤分离得到的芽孢杆菌中有10株对烟草赤星病有拮抗效果,将其中效果最好的1株芽孢杆菌定名为M-07C2F,其抑菌条带宽度达14.2 mm;通过16S rDNA测序并结合其形态和生理生化特征,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过显微观察发现,M-07C2F菌株使烟草赤星病病原真菌的菌丝生长出现畸形,菌丝体内部细胞原生质体分布不均匀,部分菌丝内原生质有流出形成空壳的现象。在离体条件下采用生长速率法,测得其对烟草赤星病菌丝生长有抑制作用,EC₅₀为12.82 mg/L;在活体条件下采用田间小区试验,测得当M-07C2F菌株粗提物质量浓度为80 mg/L时,其对烟草赤星病的防治效果达到86.0%。【结论】菌株M-07C2F对烟草赤星病菌的抑菌作用明显,该菌株通过抑制烟草赤星病菌菌丝生长、减少孢子萌发来抑制病菌对植株的侵染,且菌株粗提物质量浓度越高,抑菌能力越强。     

一种高效分离水稻细菌性条斑病菌的新方法

[目的]介绍一种将常规方法改进成为一种适用于分离存放时间过久的细条病样本的新方法。[方法]用注射器渗压法将病害标本的研磨液接种水稻叶片形成新鲜病斑后,再按改进的常规方法进行分离纯化。[结果]该新方法分离纯化可直接得到单菌落。[结论]该方法是一种适用于分离存放时间过长的水稻细菌性斑条病菌标本的方法。     

1株牛源蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

从一头猝死牛的脾脏内分离得到1株细菌,对该菌染色镜检可见其为革兰氏阳性杆菌,呈单个或链状排列。该菌对头孢氨苄、庆大霉素、诺氟沙星等药物敏感。生化检测结果和16S rDNA序列分析表明,该菌株为蜡样芽孢杆菌;经PCR检测该菌含有hbl、nhe、entFM等毒素基因以及看家基因groEL。动物致病性试验结果显示,该菌具有较强的致病性。上述结果表明,该分离菌为致病性蜡样芽孢杆菌。     

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

从土壤中分离筛选到一株具有广谱抗菌活性的拮抗细菌,命名为XZ-1。采用平板对峙培养法测定其抑菌活性,结果显示:XZ-1对大蒜叶枯病菌、草莓炭疽病菌等8种重要农作物病害的病原真菌均具有较强的拮抗活性,且抑菌带直径均大于10 mm。采用PCR扩增16S r DNA片段并用MEGA 6.0软件构建系统发育进化树,结果表明XZ-1与解淀粉芽孢杆菌16S r DNA序列KY828923聚为一簇,因此初步鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。采用单因素试验设计对XZ-1的生物学特性进行研究,结果表明:XZ-1在pH值为6时生长最佳,在氯化钠浓度为0~10g/L之间时生长情况相对较好;对光暗不敏感,致死温度为100℃、10 min。     

水稻纹枯病内生拮抗菌的分离鉴定及其生防作用

采用组织分离法,从水稻健叶分离得到一株对水稻纹枯病有较强拮抗作用的内生拮抗细菌WK1,经16S rDNA序列同源性和进化树分析,表明WK1菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),在此基础上采用混药平板法测定WK1对水稻纹枯病菌菌丝的抑制率,结果为86.67%,进而进行田间防效试验。结果表明:WK1菌株对水稻纹枯病的防治效果为52.23%,与5%井冈霉素水剂防效相当。     

9株芽孢杆菌的初步分离鉴定与拮抗性试验

通过对采集样品中细菌的分离与纯化,获得9株芽孢杆菌,经纯化培养后观察其个体和群体形态特征,并进行了12项生理生化特征鉴定。结果表明,B10为地衣芽孢杆菌,B13为巨大芽孢杆菌,B12、B14为短小芽孢杆菌,B15为苏芸金芽孢杆菌,B16为蕈状芽孢杆菌,B11,B17,B18为蜡样芽孢杆菌。通过对8株植物病原菌和3株动物病原菌的拮抗试验,初步确定B13,B16,B17,B18的抗菌谱较广,其中B10,B15对棉花枯萎菌,B13,B17对辣椒疫霉菌,B11对西瓜枯萎菌,B10,B17,B18对3株动物病原菌有较好的拮抗能力。     

水稻基腐病菌拮抗菌解淀粉芽孢杆菌E3菌株的鉴定及抑菌活性

目的 纯化和鉴定从柑橘根际土壤分离得到的可抑制水稻基腐病菌Dickeya zeae EC1生长的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens,并解析其抑菌机制。方法 采用平板扩散法从根际土壤中筛选出1株拮抗D. zeae EC1的B. amyloliquefaciens E3菌株;根据细菌菌落表型、生理生化特征结合16S rDNA序列分析等方法对E3菌株进行分类鉴定;检测无菌E3培养液对D. zeae EC1侵染水稻种子能力的影响;盐酸沉淀结合丙酮抽提法提取E3菌株脂肽粗提物;采用平板对峙法测定E3菌株脂肽粗提物对病原真菌的抑菌活性,琼脂扩散法测定E3菌株脂肽粗提物对病原细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC);用Durashell C18柱对脂肽粗提物进行HPLC分离纯化;通过液相色谱−质谱联用(LC-ESI-MS)分析,鉴定抑菌物质的相对分子质量并推测其化学组成。结果 B. amyloliquefaciens E3菌株对茄病镰刀菌Fusarium solani、香蕉基腐病菌、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum等多种植物病原菌生长具有抑制作用,表现为广谱抗性;B. amyloliquefaciens E3菌株的无菌培养液能够抑制D. zeae EC1侵染萌发的水稻种子,显著提高水稻种子的萌芽率;B. amyloliquefaciens E3菌株的脂肽粗提物可以抑制D. zeae EC1的生长,其MIC为348.97 μg/mL;HPLC分离纯化结合LC-ESI-MS分析发现,B. amyloliquefaciens E3菌株分泌的主要抑菌活性物质包括Surfactin、Fengycin和Iturin 3类脂肽类抗生素。结论 B. amyloliquefaciens E3菌株具有作为生防菌的潜力,它可能通过分泌Surfactin、Fengycin和Iturin 3种脂肽类抑菌活性物质,拮抗水稻基腐病菌、茄科劳尔氏菌、茄病镰刀菌等多种植物病原菌。研究结果可为该菌的生物防治应用提供理论依据。     

两株生防芽孢杆菌的分子鉴定及拮抗活性测定

对两株分离自青海年宝玉泽及玛多高寒草甸根围土壤的拮抗菌株GL18和MD1进行鉴定分析。生理生化试验鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌群;16SrDNA分子鉴定表明,菌株GL18、MD1与Ba-cillus methylotrophicus及Bacillus amyloliquefaciens的序列相同(或一致)性均为99%;gyrB分子鉴定表明,菌株GL18、MD1与B.methylotrophicus具有最高序列相同(或一致)性;以两株菌株的16SrDNA及gyrB基因序列与模式菌株序列构建系统发育树,结果表明,两株菌株均与B.methylotrophicus具有更近亲缘关系;综合几种鉴定结果最终将菌株GL18、MD1鉴定为B.methylotrophicus。平板对峙试验表明,菌株GL18和MD1对油菜菌核菌具有显著拮抗活性;油菜离体叶片接种试验表明,菌株对油菜菌核病菌的侵染具有较好的防效。     

一株产纤维素酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质初步研究

[目的]筛选高效分泌纤维素酶的细菌,为纤维素资源利用提供理论依据.[方法]以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源,对通过筛选培养基从森林湿泥样品中分离筛选出的细菌,采用刚果红染色、革兰氏染色和生化特性及16S rDNA进行鉴定,并对菌株产酶性质进行初步研究.[结果]获得一株纤维素酶产生菌L-30,该菌株在pH4.8、50℃条件下的酶活力为4.25 U/mL,经鉴定L-30为蜡样芽孢杆菌.酶学性质研究表明,L-30菌株所产纤维素酶最适反应pH为6.0,最适温度为50℃,该条件下酶活力最高,达4.95 U/mL,该酶对CMC-Na具有较强的分解能力;L-30菌株在最佳生长条件下,于接种后48 h即可达到产酶高峰,L-30菌株的产纤维素酶能力能稳定遗传.[结论]分离到的L-30为一株高产纤维素酶蜡样芽孢杆菌,其酶学性质好,具有进一步开发利用的价值.