培养基对尖孢镰刀菌非致病力菌株281产孢量的影响

选择8种培养基,采用液体培养法,研究培养基质对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)281菌株小孢子产生量的影响,结果表明,在PDA培养基上培养144h得到最大小孢子产量1.283×109cfu/ml,与其它培养基产孢量差异显著(P=0.05)。培养至192h时,ATCC培养基的小孢子数量达到1.325×109cfu/ml,与PDA培养基之间无显著差异(P=0.05),与其它6种培养基之间差异显著(P=0.05)。综合比较8种培养基,PDA培养基培养时间短,配制简单,是较为理想的产小孢子培养基。     

尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶异质性的研究

对黄瓜和瓠瓜不同部位以及不同寄主上分离的尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性进行了测定,结果表明,4株瓠瓜不同部位分离的尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性差异不大,分别为21.8233U、22.1663U、21.4573U和17.587U。黄瓜不同部位分离的尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性差异较大,分别为23.907U、22.0983U、35.736U和34.5323U。不同寄主尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性变化范围为10.21830U~39.82230U,其变化依次为:西瓜>黄瓜>瓠瓜>甜瓜>豇豆>辣椒。     

尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶的多态性

不同寄主尖孢镰刀菌β-D-葡萄糖苷酶活性具有明显差别,β-D-葡萄糖苷酶活性变化范围为8.7477-21.8007 U。各种瓜类作物尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性差异较大;非瓜类作物的尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性变化依次为斑兜>番茄>豌豆>辣椒。从瓜类作物上分离的尖孢镰刀菌的β-D-葡萄糖苷酶活性(平均值为13.8199 U)比非瓜类作物的高(平均值为9.6132 U)。     

紫外线对非致病尖孢镰刀菌的诱变作用

以紫外线（λ＝２３０～２６５ｎｍ）照射非致病尖孢镰刀菌３１６菌系，随着照射时间的增加，分生孢子的存活数逐渐减少，照射时间与存活菌株对农抗１２０和速克灵的变异频率间没有一定的相关性。对农抗１２０抗性增加的菌株仍保持３１６定殖西瓜幼苗导管的能力，对瓜苗的促生作用以及非致病性。在药板上用紫外线重复照射存活菌株后，获得的菌株对两种农药的变异频率均有提高，对农抗１２０的抗性有所下降，对速克灵的抗性显著提高。     

非致病尖孢镰刀菌抗药菌株的诱导

在ＰＤＡ平板上，用紫外线照射非致病尖孢镰刀菌３１６菌系分生孢子，获得５２个存活菌株。皿内测定结果表明，以致死率为７５％－８９０％的处理剂量容易获得抗药性菌株。抗药性较强的菌株定殖西瓜幼苗导管的能力均有所下降。     

尖孢镰刀菌毒素的初步研究

引起大豆根腐病的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的不同菌株产毒量不同，毒素具有较强的热稳定性。用两种方法提取毒素，结果表明用炭吸附法提取的毒素量多于乙酸乙酯萃取法。生物活性测定表明：该毒素对大豆胚根有明显的抑制作用，对大豆一出复叶期幼苗有致萎作用。尖孢镰刀菌毒素不仅对大豆种子萌发、胚根生长有抑制作用，对其它作物种子萌发、胚根生长也有抑制作用。     

紫外线对非致病尖孢镰刀菌的诱变作用

以紫外线照射非致病尖孢镰刀菌３１６菌系，随着照射时间的增加，分生孢子的存活数逐渐减少，照射时间与存活菌株对农抗１２０和速克灵的变频率间没有一定的相关性。对农抗１２０抗性增加的菌株仍保持３１６定殖西瓜幼苗导管的能力，对瓜苗的促生作用以及非致病性。在药板上和紫外线重复照射存活菌株后，获得的菌株对两种农药的变异频率均有提高，对农抗１２０的抗性有所下降，对速克灵的抗性显著提高。     

尖孢镰刀菌FoPLC4参与调控孢子形成和致病性

【目的】黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要病害,其病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）。研究旨在明确尖孢镰刀菌黄瓜专化型编码磷脂酶C（phospholipase C,PLC）的FoPLC4在调控分生孢子形成和致病性等方面的功能。【方法】采用生物信息学方法,确定FoPLC4在染色体上的位置,分析FoPLC4结构。基于尖孢镰刀菌番茄专化型基因组数据库,采用特异性引物克隆黄瓜枯萎病菌FoPLC4。根据同源重组原理构建携带潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase,HPH）基因的敲除载体,利用PEG（polyethylene glycol）介导的方法转化原生质体,获得黄瓜枯萎病菌的敲除突变体?FoPLC4和遗传回复突变体?FoPLC4/plc4。转化子经潮霉素B平板筛选后通过PCR和RT-PCR分子验证。在PDA（potato dextrose agar）培养基上测定?FoPLC4生物学性状。利用分生孢子接种黄瓜胚根测定?FoPLC4在黄瓜幼苗上的致病性。【结果】FoPLC4位于尖孢镰刀菌基因组的4号染色体,DNA全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸;FoPLC4含有5个结构域,包括EF手形（EF-hand）区、PH（pleckstrin homology）区、C2区和2个催化区,属于PLCδ亚型。与野生型菌株相比,?FoPLC4菌落生长速率没有显著改变,但气生菌丝较疏松;?FoPLC4可以同时产生大型分生孢子和小型分生孢子,大型分生孢子只占孢子总数的12.1%,而野生型菌株在相同条件下只能产生小型分生孢子,?FoPLC4产孢量下降了82.2%。致病性测定表明?FoPLC4在黄瓜幼苗上的萎蔫症状明显减轻,接种10 d后病情指数下降了53.3%。回复突变体?FoPLC4/plc4在菌落生长、产孢和致病性等性状与野生型相比没有显著差别。【结论】尖孢镰刀菌黄瓜专化型FoPLC4全长3 282 bp,不含内含子,编码1 093个氨基酸。与野生型相比,?FoPLC4分生孢子的产孢类型明显改变、产孢数量和对黄瓜幼苗的致病性显著降低。FoPLC4在调控尖孢镰刀菌分生孢子形成和致病性中发挥重要作用。     

黄瓜和西瓜尖孢镰刀菌同工酶异质性分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对同一寄主尖孢镰刀菌进行了同工酶分析。结果表明,黄瓜不同部位分离的尖孢镰刀菌过氧化物酶同工酶酶谱是相同的,均为 3条过氧化物酶(POD)同工酶酶带,迁移率分别为 0.04、0.20和 0.33;而酯酶 (EST)同工酶酶谱存在较大的差异。西瓜尖孢镰刀菌都具有 4条POD同工酶酶带,电泳迁移率分别为 0.048、0.190、0.286和0.381,而EST同工酶条带很少,且存在较大差异。     

香石竹尖孢镰刀菌PCR检测

采用多重引物聚合酶链式反应(Multiplex-PCR)技术检测香石竹尖孢镰刀菌纯培养和香石竹样品,并用分离培养技术加以验证.结果表明,PCR能特异地检测出所有16个香石竹尖孢镰刀菌菌株,并证实了昆明地区的香石竹尖孢镰刀菌为2号生理小种.PCR与分离培养技术检测结果基本一致,但总体上PCR检测阳性率稍高于分离培养检测的发病率.PCR能检测出接种7 d后香石竹病原菌,而观察病症需20 d.该项技术具有更高的灵敏度,适用于香石竹种苗的检测和病害流行学研究.     

山东省番茄尖孢镰刀菌的分离及鉴定

本研究以山东省单县番茄枯萎病及临淄、寿光、胶州、即墨、海阳、莱阳等地区的番茄颈腐、根腐病发病植株为主要试验材料,对病原菌进行分离、纯化及培养,并利用分子检测技术对供试菌株进行生理小种鉴定。结果显示,山东单县番茄枯萎病的致病菌为番茄枯萎病菌生理小种1,其他地区番茄颈腐、根腐病致病菌为番茄枯萎病菌生理小种3。     

香石竹尖孢镰刀菌PCR检测

采用多重引物聚合酶链式反应(Mulljplex—PCR)技术检测香石竹尖孢镰刀菌纯培养和香石竹样品,并用分离培养技术加以验证。结果表明,PCR能特异地检测出所有16个香石竹尖孢镰刀菌菌株,并证实了昆明地区的香石竹尖孢镰刀菌为2号生理小种。PCR与分离培养技术检测结果基本一致,但总体上PCR检测阳性率稍高于分离培养检测的发病率。PC能检测出接种7d后香石竹病原菌,而观察病症需20d。该项技术具有更高的灵敏度,适用于香石竹种苗的检测和病害流行学研究。     

尖孢镰刀菌基因组SSR位点分析

为明确尖孢镰刀菌基因组中SSR位点的分布特点,本研究利用生物信息软件SSRIT对7条已公布的尖孢镰刀菌染色体基因组序列中的SSR位点进行了搜索,并用Excel软件对其进行统计分析。结果表明:基因组中7条染色体共有860个SSR位点,平均每条染色体出现122个SSR位点,大约每44.2kb出现一个长度不小于18bp的SSR位点。其中四、五核苷酸重复为主要重复类型,占全部SSR的比例分别为23.84%和32.56%;435种重复基元的分布情况存在差异,基元为ACAA/TTGT出现次数最多,为33次,其次为CAAA/TTTG,出现32次。说明尖孢镰刀菌基因组中含有丰富的SSR位点,为Genomic-SSR标记在尖孢镰刀菌鉴别中的应用奠定了理论基础。     

枯萎病尖孢镰刀菌RAPD体系的建立

通过对PCR退火温度、反应体系中Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物浓度等因子的优化,成功建立了枯萎病菌(Fusarium oxysporum)RAPD分析技术,并对其稳定性进行检测。结果表明在退火温度36℃,体系为TaqDNA聚合酶1.5 U,dNTPs浓度0.15 mM,Mg2+浓度1.5 mM,随机引物浓度30 ng时可以建立稳定灵敏度较高的RAPD分析体系。     

尖孢镰刀菌中β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究

试验以对硝基-β-D-葡萄糖苷为底物,对尖孢镰刀菌中的β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件进行了研究,包括缓冲液pH值、底物浓度、反应温度和时间等条件对酶活性的影响。结果表明,当温度为50℃、pH5.0、底物浓度达到4 mmol/L、反应时间为16 m in时,酶活力达到最大。     

茄科尖孢镰刀菌3 个专化型细胞壁降解酶的比较

对茄科作物致病尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,FOL)、茄子专化型(F.oxysproum f. sp. melongenae,FOM)和辣椒专化型(F.oxysporum f. sp. capsicum,FOC)细胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、果胶甲基反式消除酶(PMTE)及纤维素酶(Cx)进行比较。对3个专化型分别在寄主植物体内细胞壁降解酶活性测定表明:发病茄子和番茄体内酶活性从高到低依次为PG、PMG、PGTE、Cx 和PMTE,发病辣椒体内酶活性从高到低依次为PG、PGTE、PMG、PMTE 和Cx。体外诱导试验发现,FOC所产生的PG活性比FOM和FOL高,而FOM所产生的PGTE比FOC和FOL高,3个专化型的PMG、PMTE和Cx活性没有显著差异。通过PG同工酶薄层等电聚焦电泳分析,FOL、FOM和FOC分别产生5、5、3个PG同工酶,各有1条特异的PG同工酶条带。推测此3个专化型PG同工酶的差异可能和病原菌的致病作用和寄主专化性差异有关。     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明:转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

几丁质酶及基因参与水杨酸诱导香蕉枯萎病抗性

由尖孢镰刀菌古巴专化型真菌引起的香蕉枯萎病已成为最具毁灭性的香蕉病害,严重威胁香蕉产业的健康可持续发展.因此对香蕉枯萎病病程相关基因的研究显得尤为重要.比较了Foc4侵染下,香蕉6个病菌应答相关基因的表达;分析了Foc4处理和SA+Foc4处理的易感病巴西蕉幼苗外部形态特征、几丁质酶活性及几丁质酶基因表达的变化.结果发现Ma-14-3-3c、Ma-14-3-3d、Ma-14-3-3e、Ma-14-3-3f、Ma-Cel和Ma-Chi6个基因都能在转录水平响应Foc4的胁迫;与Foc4处理相比较,SA+Foc4处理的香蕉幼苗枯萎病抗性增强,根系几丁质酶活性和几丁质酶基因表达水平提高.表明几丁质酶等6个基因参与了香蕉枯萎病的生物逆境胁迫应答,同时外源水杨酸处理能够通过诱导香蕉几丁质酶的活性及几丁质酶基因的表达增强香蕉对枯萎病的抗性.     

尖孢镰刀菌黄瓜专化型的限制酶介导整合转化

限制酶介导整合(restriction enzyme-mediated integration ,REMI)转化是在限制酶介导下用质粒DNA转化真菌原生质体,以提高大多数真菌的转化频率的一项技术.REMI的作用与原核生物的转座子技术相类似[1～3],在真菌基因标签突变、基因克隆等方面具有很大的潜力.该技术是Schiestl & Petes[1]在研究酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)时首先建立起来的.在植物病原真菌中,Lu et al.[2]首先用REMI插入突变成功标记玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus) Tox1毒素基因位点,随后,该实验室利用“质粒拯救(plasmid rescue)”的方法克隆了突变基因-PKS1[4],PKS1是T-毒素合成所必需的.在稻瘟病菌Magnaporthe grisea中利用质粒插入突变已标记了30多个与产孢、附着孢形成或致病性相关的基因[5～8] .最近,Tanaka et al.[9]利用REMI插入突变技术研究了日本梨黑斑病菌(Alternaria alternata)寄主专化性毒素(AK-毒素)生物合成所需关键基因,并成功克隆了2个与病菌产生毒素和致病相关的基因AKT1和AKT2.说明REMI插入突变技术对植物病原真菌功能基因的标记是十分有效的.     

不同豇豆品种几丁质酶粗提液对尖镰孢菌生长的影响

以南京地区栽培较多的13个豇豆品种为试材, 分别测定了它们幼苗根系粗酶抽提液中的几丁质酶活性及对西瓜尖镰孢菌生长的抑制作用, 并分析了两者之间的关系。结果表明, 各供试豇豆品种都具有几丁质酶活性, 对西瓜尖镰孢菌的生长都具有抑制作用。早熟二号豇豆的几丁质酶活性高,且比对照长白七号菜豆和新红宝西瓜对西瓜尖镰孢菌生长的抑制作用强, 但并非所有品种上述两者之间都呈正相关的。试验结果提示, 在对西瓜尖镰孢菌生长影响方面, 除了几丁质酶之外, 可能还存在其它生物因素的作用; 或者几丁质酶本身亦有抑菌活性强弱甚至有无之别。