奶牛腹腔巨噬细胞的分离与鉴定

以无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,分离获取奶牛腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态,并通过瑞氏染色计算其纯度。结果表明,采用无血清的RPMI-1640培养液灌洗奶牛腹腔,能够获得较高纯度的巨噬细胞,能为奶牛胞内寄生菌存活机制的研究提供很好的试验材料。     

血清及山羊卵丘细胞共培养对猪胚胎体外发育的促进作用

为进一步完善猪胚胎体外发育系统,以孤雌激活胚胎为研究对象,依次对胚胎培养液种类、培养期间血清添加方式、卵丘细胞共培养体系进行筛选优化。结果表明,与常规的PZM3培养液相比,CR1aa并不适合猪胚胎的体外发育;猪胚胎在PZM3中培养4d后添加10%胎牛血清培养至第6天,体外发育能力得到显著改善,卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率、囊胚细胞数分别达到95.1%、56.5%、27.3%、79.3;在此基础上,利用山羊卵丘细胞与猪胚胎进行共培养,将囊胚孵化率进一步提高至36.6%,初步建立了一套高效稳定的猪胚胎体外发育系统。     

丝裂霉素C处理后鼠胚成纤维细胞活力分析

为了探讨丝裂酶素C处理后鼠胚成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)活力的变化规律,试验用10μg/mL丝裂酶素C处理MEF,研究丝裂酶素C处理时间及其处理后细胞接种量、血清浓度和细胞代次对MEF活力的影响。结果表明,用10μg/mL丝裂酶素C处理2和3 h,MEF活力比处理4 h的稳定,处理2 h的MEF活力与处理3 h的没有显著差异;用10μg/mL丝裂酶素C处理3 h后,MEF以(0.8~1.6)×104/孔接种96孔板,其活力比2.0×104/孔和4.0×104/孔接种的稳定;用含体积分数10%犊牛血清培养液培养的MEF活力,比用含体积分数2%,5%,15%和20%犊牛血清培养液培养的稳定;第1,3代MEF活力比第5,7代的稳定。表明,用10μg/mL丝裂酶素C处理2~3 h,第1,3代MEF以(0.8~1.6)×104/孔接种96孔板,用含体积分数10%犊牛血清培养液培养,是利用丝裂酶素C制备MEF饲养层的适宜条件。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

胎牛血清和新生牛血清体外培养动物细胞的效果比较

为了比较进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新生牛血清的细胞培养效果,以2批进口胎牛血清、3批国产胎牛血清和2批国产新生牛血清为试验材料,采用细胞贴壁传代培养、最大增殖浓度和倍增时间以及集落形成率3种方法,比较了7批供试血清对VERO、CHO-K1、MDCK和Hela 4种细胞的培养效果。结果表明:连续传代培养时所有牛血清均有较好的促细胞生长的效果;进口胎牛血清、国产胎牛血清和国产新牛血清对4种细胞的平均最大增殖密度为67.8×104、62.1×104和64.8×104 cfu·mL-1,平均倍增时间为22.2、22.5和22.7h;对VERO、CHO-K1和Hela细胞的平均集落形成率为59.2%、57.6%和50.9%。3种牛血清对群体性细胞培养时效果差别不明显,对单细胞克隆培养时胎牛血清优于新生牛血清。     

培养液中血清或其替代物对牛体外受精卵体外发育的影响

探讨在牛体外受精卵体外培养液中添加血清替代品对体外受精卵发育的影响,确定血清在SOF培养液中合适的添加浓度及添加时期,以筛选优良的牛体外受精卵体外培养液.在SOF液中分别添加10%血清(NBS)、8 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和1 mg/ml聚乙烯醇(PVA)进行牛体外受精卵的全程培养,添加NBS组的卵裂率(66.3%)显著高于添加BSA组(51.0%)(P＜0.05),极显著高于添加PVA组(47.6%)(P＜0.01);添加NBS组的囊胚发育率(30.9%)显著高于添加PVA组(20.7%)(P＜0.05),极显著高于添加BSA组(13.6%)(P＜0.01).在培养液中添加不同浓度(10%、5%)的NBS及无血清培养液全程培养时,3组之间卵裂率(65.6%、60.0%、58.0%)差异不显著(P＞0.05);10%NBS组囊胚发育率(30.0%)极显著高于5%NBS组(17.6%)和无血清组(6.0%)(P＜0.01).5%NBS组的囊胚发育率极显著地高于无血清组(P＜0.01).在受精卵培养的最初48 h用5%NBS,之后用10%NBS培养液时,卵裂率(58.6%)和囊胚发育率(29.3%)与SOF+10%NBS全程培养组(66.3%、30.9%)差异都不显著(P＞0.05).试验结果表明,SOF培养液中添加PVA、BSA替代血清时卵裂率和囊胚发育率都明显下降,可能SOF培养液中添加血清比添加PVA或BSA更有利于牛体外受精卵的体外发育.体外培养时在SOF培养液中添加一定浓度的血清以及改变血清的添加方式,可提高牛体外受精卵体外发育效果.     

鸡肝原代细胞药物代谢模型的建立与优化

[目的]建立成年鸡原代肝细胞的药物代谢模型并对其进行优化。[方法]以改进的二步灌流法分离8~12周龄的雄性黄羽鸡肝细胞,比较在不同细胞基础培养液条件下鸡肝细胞体外培养的情况,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态,利用MTT检测法绘制生长曲线,测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,用q PCR和Western blot测定肝细胞中CYP450酶亚型CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和3种酶蛋白的表达量。[结果]离体灌流操作简便,获得的细胞存活率高达90%以上;用含0.5 mg·L-1牛胰岛素、10 g·L-1双抗(100 U·m L-1青霉素和链霉素)和体积分数为10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝细胞,贴壁培养时可见到肝细胞较为明显的分化过程,贴壁后呈上皮细胞样生长,多角形,胞浆内容物均匀丰富,细胞核清晰透亮,少数有双核,细胞生长状态良好。生长曲线和LDH活性测定结果显示:培养3~5 d时细胞状态稳定,并且在肝原代细胞培养的8 d内,CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和蛋白的表达量没有显著差异。[结论]以改进的二步灌流法分离鸡肝细胞操作简便,分离的鸡肝原代细胞存活率高,用含0.5 mg·L-1胰岛素、100 U·m L-1青霉素、100μg·m L-1链霉素和10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝原代细胞效果最好,培养3~5 d是进行体外药物代谢等试验的最佳时机。     

几种培养液对昆白系小鼠早期胚胎体外发育的影响

为了完善小鼠早期胚胎体外培养体系,探讨以KSOM为基础液添加新生牛血清（NBS）、胎牛血清（FBS）及BSA和G1/G2对小鼠早期胚胎体外发育的影响.结果表明：①添加10%NBS的KSOM组和G1/G2培养液组的囊胚率分别为89.52%和87.08%,二者差异不显著;②添加10?S组囊胚率为10.26%,与①中两组差异极显著;③添加0.1%BSA和0.4%BSA组囊胚率为0%,与其他三组差异极显著.添加新生牛血清的KSOM与胚胎培养液G1/G2均有效克服昆白小鼠2-细胞阻滞,并能得到较高的囊胚率.     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

孕马血清促性腺激素对狗卵母细胞体外核成熟的影响

[目的]研究孕马血清促性腺激素(PMSG;eCG)对狗卵母细胞体外成熟效果的影响。[方法]采用切割法收集卵巢表面卵丘卵母细胞复合体(COCs),并且随机分为4组,在添加不同浓度的PMSG的基础培养液(含有10%胎牛血清的DMEM)中,5%CO2,38.5℃培养箱内培养48 h。在含有0.1%透明质酸酶的D-PBS中用细小玻璃管剥离卵丘细胞从而获得裸卵,为了鉴别核成熟期,用4%甲醛溶液固定裸卵15 min,然后用10μg/ml Hoechst33342染色、压片,荧光显微镜下观察核形态。[结果]体外培养48 h后,添加PMSG处理组卵丘扩散明显,但发育到MⅠ-MⅡ的比率都没有显著差异(P(0.05)。100 IU/ml PMSG处理组GVBD期率显著低于对照组。[结论]添加PMSG改善了卵丘扩散的效果,但是没有提高核成熟率,需进一步改进狗卵母细胞体外成熟率的培养体系。     

β 巯基乙醇和发情羊血清对牛颗粒细胞体外培养的影响

为满足实验室卵母细胞体外成熟共培养和胚胎共培养的需要以及进行卵巢颗粒细胞生物学功能等研究的需要，进行牛卵巢颗粒细胞的体外培养研究。在基础培养液TCM199中分别添加12.5、25、50、100、200 μmol/L的β 巯基乙醇(BME)，观察颗粒细胞生长状况；在基础培养液中分别添加体积分数为10%的发情山羊第1天血清、体积分数为10%的发情山羊第11天血清和体积分数为10%的胎牛血清，观察颗粒细胞生长和增殖情况。体外培养颗粒细胞的活细胞率随着添加BME浓度的增大而增加，在25 μmol/L时达到最高，此后随浓度的增大而降低；发情山羊第1天的血清组中，颗粒细胞生长和增殖情况最好。BME可以提高颗粒细胞体外培养的活率，最佳添加浓度为25 μmol/L；发情山羊第1天的血清可有效促进颗粒细胞体外培养生长和增殖。     

血清浓度对鸡胚盲肠上皮细胞原代培养的影响

为探讨细胞培养基中血清浓度对鸡盲肠上皮细胞体外培养的影响,分别用含0%、2.5%、5%和10%胎牛血清(FBS)的细胞培养液培养鸡胚盲肠上皮细胞,检测细胞活性;选择适宜的FBS浓度,并测定了该浓度条件下鸡盲肠上皮细胞的生长特性。结果表明:用含2.5%和5%FBS的培养基培养鸡胚盲肠上皮细胞,第4天细胞贴壁率达最高,分别为84%和80.33%,显著地高于无血清和10%FBS组(P<0.01/0.05),第7天仍均维持在76%以上,两者间除了第2天外,其余差异均不显著;用含2.5%FBS的细胞培养基进行鸡胚盲肠上皮细胞原代培养,第2~3天为适应阶段,第3~5天处于对数生长期,第5~9天细胞进入减速期,第10~11天再次进入对数生长期,第11天以后细胞进入衰退期,整个过程持续14 d左右。鸡胚盲肠上皮细胞培养的血清浓度以2.5%FBS为宜。     

不同牛血清促悬浮培养BHK21细胞生长的作用

[目的]验证成年牛血清在细胞培养过程中对细胞的促生长作用。[方法]分别以商品胎牛血清、新生牛血清、处理的成年牛血清进行悬浮培养BHK21细胞,通过细胞密度、细胞活力等指标来检测各血清对细胞的促生长作用。[结果]3种血清对细胞的促生长作用差异不明显,都具有良好的促细胞生长作用。[结论]处理的成年牛血清具有良好的促细胞生长作用,与胎牛血清、新生牛血清促细胞生长作用差异不明显。     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

发情期家兔输卵管上皮细胞和基质细胞的分离培养与鉴定

【目的】探讨输卵管上皮细胞和基质细胞的体外分离培养方法及在激素刺激下基质细胞对上皮细胞的作用。【方法】通过差速贴壁法体外分离纯化兔输卵管上皮细胞和基质细胞;免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法鉴定上皮细胞和基质细胞的类型和纯度;并在无胎牛血清的DMEM/F12培养液和含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液中,分别添加不同浓度的雌激素(17β-E2)和孕激素(P4),比较上皮细胞和基质细胞的增殖情况及其对上皮细胞/基质细胞共培养的影响。【结果】体外成功地分离到兔输卵管上皮细胞和基质细胞;兔输卵管上皮细胞经鼠抗人细胞角蛋白单克降抗体(anti-CK18)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在98%以上;兔输卵管基质细胞经鼠抗人波形蛋白单克降抗体(anti-Vimentin)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在95%以上。17β-E2和P4均能促进兔输卵管上皮细胞和基质细胞的增殖,使其数量明显增加。基质细胞与上皮细胞共培养,上皮细胞增殖较快。【结论】差速贴壁法能够获得纯度较高的输卵管上皮细胞和基质细胞,在17β-E2和P4共同作用下,少量基质细胞能促进上皮细胞生长。     

小鼠早期胚胎体外培养的实验研究

本试验采用国产化学试药和哈尔滨地区的天然水,制备了 Brinster 化学合成培养液。把160枚通过超数排卵获得的2-细胞期小鼠胚胎放在添加适量牛血清白蛋白或胎牛血清的 Brinster 化学合成培养液内,并在适当湿度、5%CO_2和95%空气的气相环境、37℃温度条件下培养。58小时后,大约67%4小鼠2-细胞期胚胎发育到桑椹胚阶段;大约32%的小鼠桑椹胚发育到囊胚期阶段。试验证明,用国产化学药品和哈尔滨地区水配制的培养液可以对早期小鼠胚胎进行体外培养研究。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及鉴定

为了建立一种体外培养兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)的方法,在无菌条件下取家兔双侧腹股沟脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化后,用含10%胎牛血清的DMEM 培养液培养.细胞连续传代后,MTT法检测第3、5、10代细胞的增殖情况.采用油红染色法和Von Kossa染色法观察第3代ADSCs向成脂和成骨方向分化情况,并采用流式细胞仪分析细胞表面标志.结果显示,第3、5、10代的ADSCs生长曲线并无显著差异,细胞增殖较快;ADSCs成脂诱导后油红染色阳性,成骨诱导后Von kossa染色形成典型的黑色钙化结节.ADSCs 表面标志检测结果为:CD29 和CD90阳性,CD45和CD80阴性.成功分离和培养了兔的ADSCs,其具有成脂和成骨潜能,可作为组织工程的种子细胞.     

赤点石斑鱼皮肤的体外培养

以赤点石斑鱼为材料,无菌操作剥离皮肤,并剪成大小为O.5-1.O cm的外植块,于25℃进行体外培养.观察结果显示,赤点石斑鱼皮肤外植块在含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液中存在生长活性,3 d后长出上皮样细胞,6～7 d形成岛屿状细胞集落,12-14 d长满呈"铺路石"状.研究结果表明,皮肤外植块在体外维持生长状态达30 d以上,培养30 d的悬浮细胞存活率为5l.4%,提示皮肤上皮细胞状态良好.     

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。     

改良培养基对体外培养生精细胞增殖分化的影响

探讨改良培养基对体外培养小鼠生精细胞的增殖分化效应。根据培养基的不同分为:A组(基础培养液组);B组[基础培养液+胶质细胞神经营养因子(GDNF)+表皮生长因子(EGF)组];C1、C2和C3组[A组+20%、40%、80%睾丸液(TA)];D1、D2和D3组(B组+20%、40%、80%TA)。采用上述8种培养基对7~8日龄小鼠生精细胞进行体外培养,通过细胞形态学观察、细胞存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨TA、GDNF和EGF对小鼠体外培养生精细胞的增殖分化效应,结果如下:(1)形态学观察表明,B组生精细胞生长速度快,形态好,细胞集落多,A组最差;C组和D组细胞传代后培养时间最长,可达4个月。(2)生精细胞存活率结果显示,培养20 d的B组细胞存活率显著高于其他各组(P0.05),C、D组在各培养阶段与A组间无显著性差异。(3)TP1/P19培养15 d后B组的TP1/P19显著高于其他各组(P0.05),其他各组间均无显著性差异。(4)单倍体精子细胞比例结果表明,培养15 d后的B组单倍体细胞比例显著高于其他各组(P0.05),其他各组间单倍体细胞比例均无显著性差异。GDNF和EGF可显著提高生精细胞体外培养的增殖分化效应,而睾丸液可显著延长生精细胞体外培养时间。