A型魏氏梭菌毒素毒力测定替代试验

通过Kaerber方法测定α毒素对小鼠的半数致死量后 ,定量出 10LD50 毒力标准的毒素所能引起卵磷脂水解反应的稀释度为 6 ,每一水解稀释度相当于LD50 /6 4的毒力标准 ,从而建立起A型魏氏梭菌毒素毒力测定动物试验的替代试验。α毒素毒力与卵磷脂水解反应的浑浊度在该试验条件下具有稳定的相关性 ,不同批次的卵磷脂及毒素中所含菌体的数量对试验结果的判定无影响。该替代试验比原方法操作更简单 ,取材也经济 ,并能对毒素毒力进行定量计算     

头功铁药散对A型魏氏梭菌α毒素的mRNA表达及损伤小鼠免疫功能的影响

探讨自拟处方头功铁药散对A型魏氏梭菌α-毒素损伤小鼠免疫功能的影响,并检测了α毒素mRNA表达的情况.检测小鼠部分免疫功能;荧光定量RT-PCR法检测α毒素基因mRNA表达的变化.结果显示,与模型组相比,头功铁药散能拮抗α-毒素对小鼠的损伤,极显著提高小鼠免疫器官指数及巨噬细胞的吞噬能力(p0.01);与细菌模型组相比,头功铁药散能极显著降低α毒素基因表达(p0.01).推测头功铁药散可通过提高小鼠免疫功能,并下调α毒素基因表达,从而减少α-毒素对小鼠的损伤.     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

魏氏梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与表达

提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridium welchii贵州分离株的染色体DNA，经酶切回收分子长2～4kb的DNA片段混合物，将其插入质粒载体pUCl9中，并转化至E．coli JMl09，通过Amp抗药性和显色反应的选择，再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切分析和PCR鉴定，筛选出含魏氏梭菌α-毒素基因的重组大肠杆菌；经溶血与溶血抑制试验及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，重组E．coli的表达产物符合α-毒素的生物学特性。     

獭免A型魏氏梭菌病的诊治

魏氏梭菌又称魏氏梭菌性肠炎或兔肠毒血症，主要是由A型魏氏梭菌及其毒素引起的以急性水样腹泻和高死亡率为特征。     

头功铁药散对 A 型魏氏梭菌α毒素的 mRNA表达及损伤小鼠免疫功能的影响

探讨自拟处方头功铁药散对 A 型魏氏梭菌α毒素损伤小鼠免疫功能的影响,并检测了α毒素 mRNA 表达的情况．检测小鼠部分免疫功能;荧光定量 RT‐PCR 法检测α毒素基因 mRNA 表达的变化．结果显示,与模型组相比,头功铁药散能拮抗α毒素对小鼠的损伤,极显著提高小鼠免疫器官指数及巨噬细胞的吞噬能力（p ＜0.01）;与细菌模型组相比,头功铁药散能极显著降低α毒素基因表达（p ＜0.01）．推测头功铁药散可通过提高小鼠免疫功能,并下调α毒素基因表达,从而减少α毒素对小鼠的损伤．     

A型产气荚膜梭菌α毒素的基因扩增和提纯鉴定

为了对A型产气荚膜梭菌α毒素快速准确地做出检测,本实验利用厌氧肉肝汤培养A型产气荚膜梭菌,经革兰染色观察以及含铁牛奶培养基观察其生化特性.然后使用饱和度为60％的硫酸铵粗提其α毒素蛋白,进行透析纯化并应用SDS - PAGE方法鉴定A型产气荚膜梭菌的α毒素,鉴定之后将纯化的α毒素给小鼠腹腔注射来检测其活性.结果表明,厌氧肉肝汤培养基变浑浊且产生大量气体,含铁牛奶培养基发生爆烈发酵现象,SDS - PAGE检测结果,α毒素分子量为43.6kDa,小白鼠出现梭菌病的典型临床症状.本实验为α毒素的鉴定及大量快速提取提供了一种参考方法,为进一步开展梭菌毒素的致病机理及制备类毒素疫苗奠定重要的实验基础.     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

獭兔A型魏氏梭菌下痢的诊治

A型魏氏梭菌下痢是由A型魏氏梭菌所产外毒素引起的肠毒血症,以急剧腹泻、排黑色水样或带血胶冻粪便,盲肠浆膜出血斑和胃粘膜出血、溃疡为特征。兔场一旦感染此病,其发病率可达90％以上,病死率高达100％,严重危害着养兔业的发展。     

C型魏氏梭菌外毒素产生的主要影响因素研究

从不同菌株、不同培养基、不同培养温度和不同培养时间对C型魏氏梭菌在培养过程中毒素产生的影响及不同菌株的交叉保护力方面进行了研究.结果表明,在3株C型魏氏梭菌中.C_(59-2)株在相同培养条件下产生的毒素最高,肉肝胃酶消化汤更有助于该菌株产生高滴度的致死性毒素,并且在35℃培养16-20 h后可产生较高滴度的致死性毒素,1μL魏氏梭菌培养物上清液即可致8/8小鼠死亡,不同菌株之间具有较好的交叉免疫力,这些结果为研制C型魏氏梭菌高效疫苗打下了基础.     

兔病毒性出血症与A型魏氏梭菌二联苗的研究

将兔病毒性出血症疫苗与浓缩的A型魏氏梭菌菌苗按1：1混合制成联苗。试验证明，此苗安全有效。联苗2ml／只免疫，兔病毒性出血症第4天可产生免疫力，保护率为100％；A型魏氏梭菌21天产生免疫力，保护率为82．14％。     

A型产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因核苷酸序列与蛋白结构分析

为了对产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因进行分析,通过生物软件设计引物,扩增A型产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因,测序后对tetB(P)基因核苷酸序列与蛋白结构进行分析.结果表明:分离株tetB(P)基因长度为1 959bp,编码652个氨基酸.与参考菌株CW92、EHE-NE18的核苷酸序列同源性依次为99.7%、99.9%,氨基酸序列同源性依次为99.4%、99.8%.分离株tetB(P)蛋白亲水性氨基酸较多,无跨膜区,含有4个N-糖基化位点,1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,9个蛋白激酶C磷酸化位点,12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,7个N-豆寇酰化位点,1个ATP/GTP结合位点基序,1个翻译型鸟苷酸结合域,三级结构主要是由α-螺旋、β折叠和无规则卷曲形成.     

D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白结构及抗原表位分析

利用生物软件对D型产气荚膜梭菌ε毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析。综合ε毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B细胞抗原表位,三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153抗原表位区内。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和出血性肠炎,严重时可导致死亡。α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学角度对该毒素进行研究具有重要意义。对α毒素的分子生物学结构和致病机理进行了简要概述,并介绍了国内外对产气荚膜梭菌α毒素的检测方法和防治措施,以期为研究产气荚膜梭菌α毒素的致病机理以及预防和治疗动物气性坏疽、肠道出血症奠定基础。     

C型产气荚膜梭菌β毒素蛋白结构及抗原表位预测

利用DNASTAR、I-Tasser软件对C型产气荚膜梭菌β毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析.综合β毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,B细胞抗原表位可能位于肽链2~4、7~16、23~26、36~40、55~58、72~75、172~179、190~193、196~203、211~214、246~249位氨基酸区域;结合三级结构预测结果显示,190~193、211~214成为表位的可能性较大.     

IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对已构建的含β2毒素基因重组质粒p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测不同培养条件下β2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实,p ETXB2重组质粒含有β2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时采用IPTG诱导剂在改变培养基的p H、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间4个方面对β2毒素基因表达进行调控,其最佳的表达条件是37℃,p H 7.0的培养基中,用终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导4 h,β2毒素蛋白的表达效果最好。     

产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。