产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。     

A型魏氏梭菌α毒素氨基端PLC结构分析与生物学活性鉴定

利用PCR扩增技术克隆A型魏氏梭菌α毒素氨基端的PLC1-250基因,构建含PLC1-250基因表达质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组菌株,序列分析和酶切鉴定证实构建的p N-PLC1-250重组质粒含有目的基因且基因序列与阅读框架均正确。SDS-PAGE分析表明,PLC1-250蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的18.76%。利用SOPMA法预测PLC1-250蛋白分子的二级结构,且同源模建了其3D结构,结果表明,PLC1-250蛋白分子的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,三级结构与α毒素相类似。此外,还对其生物学活性进行了鉴定,可为进一步探索α毒素作用的分子机制,以及其分子结构与生物学功能的关系奠定基础。     

鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究

从鸡源产气荚膜梭菌C57-86中PCR扩增出a毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-a,并进行核苷酸序列进化分析。结果表明,鸡源产气荚膜梭菌的a毒素基因与参考菌株strain AL08-16相似性较高,核苷酸同源性为97.7%。对重组菌株BL21/KG-a诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,重组菌株BL21/KG-a可以高效地表达毒素蛋白质;免疫试验表明,表达产物免疫的SPF试验鸡可抵抗A型产气荚膜梭菌的攻击。     

抗α毒素1D5单抗ScFv基因表达菌株生物学活性的研究

为研究抗A型魏氏梭菌α毒素ScFv蛋白的生物学功能,利用PCR技术克隆抗α毒素1D5单抗的ScFv基因,构建含ScFv基因表达质粒pHOG-1D5的重组表达菌株XL1-BLUE (pHOG-1D5)。酶切鉴定和序列分析证实构建的pHOG-1D5重组表达质粒含有ScFv基因,且基因序列和阅读框架正确。ELISA检测结果表明在重组菌株XL1-BLUE (pHOG-1D5)培养上清和细胞周质中均检测到目的蛋白。SDS-PAGE分析表明目的蛋白表达量占菌体总蛋白相对含量的29.2%。同时对ScFv蛋白生物学活性进行检测,结果表明其能中和α毒素的卵磷脂酶活性且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用,从而为临床治疗α毒素中毒奠定了坚实基础。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的自诱导分泌表达及免疫原性分析

为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1～2 g/L、28℃诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。     

魏氏梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与表达

提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridium welchii贵州分离株的染色体DNA，经酶切回收分子长2～4kb的DNA片段混合物，将其插入质粒载体pUCl9中，并转化至E．coli JMl09，通过Amp抗药性和显色反应的选择，再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切分析和PCR鉴定，筛选出含魏氏梭菌α-毒素基因的重组大肠杆菌；经溶血与溶血抑制试验及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，重组E．coli的表达产物符合α-毒素的生物学特性。     

A型产气荚膜毒素培养工艺研究

兔魏氏梭菌病是A型魏氏梭菌产生的外毒素引起的一种急性、致死性传染病,A型魏氏梭菌致病因子是菌体产生的外毒素,其中主要是产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens,CPA).如果要生产优质高效的A型魏氏梭菌疫苗,就必须培养出含大量活性的α毒素菌苗.试验采用A型魏氏梭菌菌种,按照不同比例、不同代次菌种接种及培养基中加入糊精、蛋白胨、硫乙醇酸盐物质等方法,对所产生的A型产气荚膜毒素量、生物活性进行了对比,拓宽了A型产气荚膜毒素培养工艺,对临床A型魏氏梭菌菌苗的生产和检验提供了一定地技术指导.     

头功铁药散对A型魏氏梭菌α毒素的mRNA表达及损伤小鼠免疫功能的影响

探讨自拟处方头功铁药散对A型魏氏梭菌α-毒素损伤小鼠免疫功能的影响,并检测了α毒素mRNA表达的情况.检测小鼠部分免疫功能;荧光定量RT-PCR法检测α毒素基因mRNA表达的变化.结果显示,与模型组相比,头功铁药散能拮抗α-毒素对小鼠的损伤,极显著提高小鼠免疫器官指数及巨噬细胞的吞噬能力(p0.01);与细菌模型组相比,头功铁药散能极显著降低α毒素基因表达(p0.01).推测头功铁药散可通过提高小鼠免疫功能,并下调α毒素基因表达,从而减少α-毒素对小鼠的损伤.     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

C型产气荚膜梭菌α、β1、β2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXAl中扩增出0.95 kb α毒素基因,将其连接到经Nco I单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kb β1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kb α-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实.构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导荆诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基PH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol.L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.     

噬菌体裂解酶Cp51在重组乳酸菌中的表达及对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性

【目的】构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis,并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。【方法】全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因,构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体,电转化至乳酸菌NZ9000,经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白;用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性;利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。【结果】噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达,为1 268 bp;质量浓度1μg·mL-1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性;重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果,混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×10~9 CFU·mL~(-1)下降到约9×10~8 CFU·mL~(-1)。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功,为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。     

头功铁药散对 A 型魏氏梭菌α毒素的 mRNA表达及损伤小鼠免疫功能的影响

探讨自拟处方头功铁药散对 A 型魏氏梭菌α毒素损伤小鼠免疫功能的影响,并检测了α毒素 mRNA 表达的情况．检测小鼠部分免疫功能;荧光定量 RT‐PCR 法检测α毒素基因 mRNA 表达的变化．结果显示,与模型组相比,头功铁药散能拮抗α毒素对小鼠的损伤,极显著提高小鼠免疫器官指数及巨噬细胞的吞噬能力（p ＜0.01）;与细菌模型组相比,头功铁药散能极显著降低α毒素基因表达（p ＜0.01）．推测头功铁药散可通过提高小鼠免疫功能,并下调α毒素基因表达,从而减少α毒素对小鼠的损伤．     

新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒（New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV）Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析，选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487～627 aa，后全基因合成序列，并在其C末端添加His-tag标签，利用无缝克隆的方法，将该段基因克隆至pET-28a(+)载体，随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌，诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔，制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒，纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa，主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性，可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位，满足进一步研究的需要。     

表面展示C型产气荚膜梭菌α,β毒素蛋白重组乳酸菌的 构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌的高密度发酵和免疫效果

为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21 d进行二免,分别测定一免、二免动物混合血清的中和效价。发酵结果显示,培养物菌体密度D_(600 nm)达20.3,相对表达量为27.6%,D_(600 nm)与相对表达量的乘积为摇瓶培养的6.5倍,菌体湿质量为37.2 g/L;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,目的蛋白以可溶形式表达。动物免疫效果评价结果显示,在家兔和绵羊上,抗原含量与免疫效果在一定的范围内均呈正相关,当接种量为300μg/只时,免疫效果均最好;对腐败梭菌毒素与D型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价,在家兔上一免、二免分别达4与30、15与200,在绵羊上一免、二免分别达2与30、12与250。结果表明,DE3-pET-AE菌高密度发酵可获得高产量蛋白抗原,且抗原的免疫效果明显优于《中华人民共和国兽药典》合格标准。     

嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气溶素(aerolysin,Aer)基因的序列设计引物,以来自湖北的鱼源A.hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定。测序结果表明,A.hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支,国外菌株聚为一支。通过pET-32a(+)载体构建Ah15株aer基因的表达载体pET32a-15,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行诱导表达,通过SDS-PAGE分析,显示与预期大小约72.2ku相吻合的融合蛋白带,且以包涵体形式存在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清,Western blot结果显示,兔抗血清可以识别A.hydrophila的重组毒素,说明该基因的重组蛋白具有很好的免疫原性,可作为A.hydrophila基因工程疫苗研制的候选基因。     

气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank中气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因的参考序列,采用PCR方法扩增细胞毒素CctA基因。在将该基因进行克隆和测序后利用生物信息学方法,对细胞毒素CctA蛋白的理化性质、结构功能域、蛋白质二级结构和三级结构及抗原表位等重要参数进行了预测和分析。结果表明:与参考序列(JQ692583)相比,存在3处突变,核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性均为99.4%;CctA蛋白的理论等电点为8.00,不存在跨膜区和信号肽序列,二级结构以β-折叠和无规则卷曲为主,主要有4个抗原表位区域。本研究为CctA蛋白功能的深入研究提供了参考,并为气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及合成肽疫苗的研发奠定了基础。