羊口疮病毒F1L蛋白对山羊痘病毒黏附BHK21细胞的影响

以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板,用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列,并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析;优化合成059基因编码序列,连接载体pET42a(+),转化Escherichiacoli BL21(DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌,采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白,并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度;将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层,分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育,利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量,研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列,其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域,显示出肝素结合活性;该蛋白羧基端有2个跨膜区,不利于蛋白质的表达,但优化DNA序列构建的重组质粒菌,经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达;免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性;Bra...     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

羊口疮病毒B2L基因克隆及表达

为了获得羊口疮病毒囊膜蛋白。以羊口疮病毒基因组为模板,利用羊口疮病毒B2L基因特异性引物,进行PCR扩增,回收以及纯化PCR产物,连接到PMD18-T载体上,测序结果表明B2L基因全长1 137 bp,编码379个氨基酸。再将B2L基因克隆至p ET-30a,构建原核表达载体p ET30a-B2L。经菌液PCR、酶切鉴定以及SDS-PAGE等方法表明成功构建原核表达载体,这将为今后的单抗制备以及羊口疮病毒的疫苗研究打下基础。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病.O2O基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白.根据GenBank中O2O基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因.然后将其亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-ORF-020.鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析.最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清.SDS-PAGE结果表明,ORFV O2O基因在体外获得正确表达,大小约37 kDa.Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与O2O蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性.     

羊口疮病毒内脏和口唇感染株B2L和F1L基因的比较分析

【目的】分析内脏和口唇感染羊传染性脓疱病病毒主要致病因子F1L和B2L基因和蛋白的差异,为进一步研究该病毒的致病机制提供参考。【方法】对内脏和口唇感染株F1L和B2L基因进行PCR扩增后克隆测序,运用生物信息学软件对其序列及编码蛋白的二级结构、磷酸化位点和跨膜结构域进行预测和分析。【结果】内脏株和口唇株的F1L基因长度均为1 564 bp,分别编码342和343个氨基酸;B2L基因长度均为1 370 bp,均编码378个氨基酸。内脏和口唇感染株B2L基因核苷酸序列同源性为97.80%,氨基酸序列同源性为98.15%;两者的F1L基因核苷酸序列同源性为95.49%,氨基酸序列同源性为87.20%。氨基酸组成显示：内脏和口唇感染株B2L蛋白缬氨酸含量最高;口唇株F1L蛋白亮氨酸含量最高,内脏株F1L蛋白精氨酸含量最高。【结论】羊口疮病毒内脏和口唇感染株的B2L基因保守性良好,而F1L基因差异明显,本结果可为进一步研究羊口疮病毒致病机制提供参考。     

羊口疮病毒115基因的克隆及原核表达

【目的】获得羊口疮病毒（ORFV）115基因表达蛋白。【方法】利用Oligo 7软件设计并筛选出115基因特异性扩增引物,以ORFV FJ-ND株基因组为模板,通过PCR技术扩增获得其基因序列,再将115基因克隆至pGEX-6p-1上,重组质粒pGEX-6p-115,并对其进行测序鉴定,鉴定正确后转化RosettaganmiB(DE3)感受态细胞,通过优化IPTG浓度和诱导时间获得重组融合蛋白最佳表达条件,用SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行分析。【结果】115基因全长450 bp,编码149个氨基酸;115基因可以在RosettaganmiB中表达,重组蛋白分子大小约42 kDa,主要以包涵体形式表达。【结论】成功克隆了ORFV 115基因,构建了pGEX-6P-115原核表达质粒,优化了重组蛋白表达条件并进行纯化,为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。     

4份临床样品中羊口疮病毒F1L、B2L和GIF基因的进化分析

【目的】研究2021年福建省部分羊场羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）分子流行病学情况。【方法】对2021年采集的4份病料经PCR鉴定ORFV阳性的临床样品分别克隆其F1L、B2L和GIF基因,将获得的克隆质粒送往测序公司进行测序,将测序拼接后的序列上传至GenBank数据库中,利用生物信息学软件进行对比分析。【结果】4份临床样品中ORFV的F1L、B2L和GIF基因核苷酸序列相似性分别为98.0%～98.8%、98.4%～99.5%和97.2%～99.6%;与国内流行毒株核苷酸序列相似性分别为97.4%～99.4%、97.4%～99.9%和95.7%～99.0%;与国外流行毒株核苷酸序列相似性分别为97.5%～98.6%、97.9%～98.9%和95.6%～98.0%;与德国D1701弱毒株核苷酸序列相似性分别为96.5%～96.8%、98.0%～98.7%和96.0%～96.4%,与NZ2参考株核苷酸序列相似性分别为97.7%～98.1%、97.5%～98.1%和95.9%～96.1%。遗传进化树结果显示4份临床样品中ORFV与吉林（NA17、SY17和CL18株）、福建...     

羊口疮的防治

<正> 1、病因 羊口疮又叫“羊传染性脓疱”,是绵羊和山羊的一种由病毒引起的传染病。羊口疮多于春秋两季群发于3-6月龄羊,成年羊也可感     

羊口疮的研究

本文报道了对羊口疮的病原学、流行病学、实验病理学、血清学诊断以及免疫预防等问题所进行的系列研究结果。应用电镜技术,首次在国内观察到了羊口疮的病原——羊口疮病毒。对该病毒的某些生物学特性和理化学特性进行研究的结果表明,该病毒的感染范围比较广泛,对干燥耐受性强,对热、紫外光和福马林敏感;在奶山羊睾丸细胞上生长良好,CPE变化显著,并有多倍性现象;通过系统取样和超薄切片,在电镜下观察到了病毒在培养细胞中的主要复制过程,以及培养细胞本身的亚微结构变化。试用差速离心联用30—45％蔗精密度梯度超速离心,能有效地提纯病毒,为纯化痘类病毒提供了一种较为理想的方法。中性无离子去污剂TritonX—100与2—巯基乙醇联合,可使病毒裂解,便于分离囊膜蛋白亚单位;用SDS—PAGE分析法,发现病毒最少可泳动出28条多肽区带,而病毒的囊膜亚单位则由18条多肽区带组成。将病毒亚单位作为抗原免疫羔羊,可激发羊只产生抗全病毒抗体和迟发性变态反应,这在国内属首次报道。流行病学的调查表明,羊口疮在甘肃省存在历史已久,分布广泛,对养羊业危害严重;病的自然感染主要见于绵羊和山羊,以羔羊最为易感,除口唇感染外,未见其他临诊病型;采取不同地区的病羊痂皮在羊体作交叉免疫试验,未发现病毒有型别差异。人工感染病羊的血常规检查和血清蛋白的电泳分析未见异常;病理组织学变化以表皮的网状变性、真皮的炎性浸润和结缔组织增生为最特征。首次在国内将反向间接血凝、对流免疫电泳、酶联免疫吸附,琼脂凝胶扩散以及血清中和等五种血清学方法用于羊口疮的诊断,填补了国内在这方面的空白,其中前三种方法在当时的国外文献中也未见有报道。以改良、完善现行方法为目的,对活毒苗免疫接种法作了系统的研究,证明是一种行之有效的应急性免疫措施,有在疫区推广应用的价值;对灭活苗所进行的探索性试验表明,灭活的病毒似能激发羊体产生一定程度的免疫,为今后进一步提高灭活苗的免疫效果以及研究其在实践中应用的可能性打下了有益的基础。     

羊口疮的防治

1.病因羊口疮又叫“羊传染性脓疱”,是绵羊和山羊的一种由病毒引起的传染病。羊口疮多于春秋两季群发于3～6月龄羊,成年羊也可感染,但发病较少,呈散发性流行。病羊和带毒羊是主要传染源。自然感染主要是因购入病羊的带毒羊传入,或是利用受污染的畜舍及草地而感染。2.症状病羊以     

羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.     

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析

试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。     

羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析

【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示,ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%~97.9%和86.7%~97.4%;3个毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%~97.3%,85.2%~97.0%和71.5%~98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的,且其毒力基因发生了较大的变异。     

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。     

PEDV CH-HeB14株S1蛋白表达及其多克隆抗体的制备

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体,为PEDV新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CH-HeB14毒株S1基因,对序列特征进行生物信息学分析,用PCR将S1基因截成不同片段(S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2),分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株;用IPTG诱导重组蛋白表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制备免疫原免疫兔多克隆抗体,Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。【结果】PEDVS1、S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2片段长度依次为2 079,600,600,878,549和447bp。系统进化树表明,CH-HeB14株与2010年以来的22个新流行毒株亲缘关系较近,而与经典疫苗株CV777、attenuated DR13亲缘关系较远。成功截短表达了S1蛋白不同区段S1A、S1B和S1C-1重组蛋白(rS1A、rS1B和rS1C-1),且蛋白均以包涵体形式表达。制备了抗rS1A、rS1B和rS1C-1蛋白的多克隆抗体,其与这3种蛋白反应良好,且抗rS1A重组蛋白的多克隆抗体Western blotting效价为1∶32 000;IPMA结果显示,该抗体能与PEDV CHHeB14毒株和经典疫苗毒株attenuated DR13均发生特异性反应。【结论】成功克隆、表达了变异毒株PEDV CHHeB14的S1基因,所制备的S1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。     

羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.     

羊口疮病毒DZ株在不同细胞上的增殖特性研究

为研究羊口疮病毒(ORFV) DZ株在不同细胞上的增殖特性,将ORFV-DZ株分别接种犊牛睾丸细胞(BT)和鸡胚成纤维细胞(CEF)2种原代细胞,以及山羊皮肤成纤维细胞系(GSFs)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)、宫颈癌细胞系(Hela)、牛肾细胞系(MDBK)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Ver...     

鸡细小病毒NS1和VP2蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0...