4株鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列分析

试验从发病鸡场分离获得4株鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）,分别为河北株（HB）、湖北株（HUB）、山东株（SD）、山西株（SX）。通过特异性引物扩增VP2基因并进行测序,序列分析结果显示,4株病毒中,HUB、SD和SX的七肽区为S-W-S-A-S-G-S（aa 326S-332S）,其222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位是传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）的4个特征性氨基酸,确定这3株病毒均为超强毒株;而HB株七肽区为S-W-S-A-R-G-S（aa 326S-332S）,其222（P）、256（V）、294（L）和299（N）位氨基酸显示该毒株属于弱毒株。进化树分析结果显示,HUB、SD和SX 3株病毒与2011年中国分离的大部分IBDV毒株亲缘关系较近,同源性在96%以上,同时与经典毒株Cro-Po/00、超强毒株GX和UK661亲缘关系很近;而HB株与减毒疫苗株D78株和B87株的亲缘关系近。本试验结果表明,IBDV目前在中国流行呈混发型,但以超强毒株为主。     

鸡传染性法氏囊病病毒PCR检测及VP4基因序列分析

从滨州地区某养鸡场疑似鸡传染性法氏囊病病鸡初步分离到一株记为HSJ12分离株的IBDV毒株,从该分离株中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增VP4基因。结果表明,测序结果与GenBank中报道的IBDV VP4序列同源性在95%～99%之间。将VP4基因测序序列与GenBank上报道的23个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与ks株同源性最近,而与23-82、OH株同源性最远。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离与VP2基因序列分析

为了探讨传染性法氏囊病流行的原因,从4个发生传染性法氏囊病的鸡场采集病变法氏囊,处理后用特异性单克隆抗体进行荧光检测,结果均为阳性;然后提取病毒RNA,利用RT-PCR扩增病毒VP2基因cDNA并进行序列和遗传进化分析.结果表明:所分离的4株病毒均具有超强毒的分子特征,属于传染性法氏囊病病毒超强毒病毒群,4株病毒在第1亲水区的212位有1个氨基酸突变(D→N);HLJ-3和HLJ-4在第2亲水区321位还有1个突变(A→V),这些突变可能造成传染性法氏囊病病毒的抗原发生变异,进而发生免疫失败.     

鸡传染性法氏囊病TL株VP2基因克隆及部分特性分析

传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus IBDV）是引起禽免疫抑制性疾病的一种主要病原体，属于双链RNA病毒科，禽双节段RNA病毒属成员。其基因组由两个节段dsRNA（A、B）构成，大片段A长约3．4kb，编码一条多聚蛋白，该蛋白随后裂解为VP2、VP3和VP4。小片段B长约为2．9kb，编码VP1。其中VP2携带宿主保护性抗原决定簇，具有至少两到三个中和性抗原位点，可以诱导产生保护性中和抗体，并且有血清型特异性。Ⅰ型IBDV毒株的VP2cDNA核苷酸及相应氨基酸残基序列中，共同存在着一个高度可变区（AccⅠ～SpeⅠ）含有两个亲水区和一个七肽区。     

鸡传染性法氏囊病病毒XX08株VP2高变区基因的克隆与序列分析

应用反转录(RT-PCR)技术从河南新乡某鸡场分离的鸡传染性法氏囊病病毒XX08株总RNA中克隆出593bp的VP2高变区基因。序列分析表明,XX08毒株VP2高变区氨基酸序列与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM以及经典弱毒株D78的同源性均为96.8%。遗传进化分析表明,该毒株与超强毒株UK661和OKYM位于同一进化树。XX08毒株与超强毒株具有相似的氨基酸特征,但是222位的A被P替代,提示XX08毒株可能为中等强毒力毒株。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IBDVvP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT—PCR技术扩增出了1．5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

1株传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

【目的】 研究1株传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩散试验等方法分离鉴定病毒,并扩增其VP2基因,利用Mega 7.0、MegAlign软件将其与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及氨基酸序列比对分析,并进行SPF鸡致病性试验,用实时荧光定量PCR方法测定IBDV拷贝数变化情况。【结果】 成功分离到1株IBDV毒株,命名为GX20210126株。该毒株接种SPF鸡胚可导致鸡胚出现出血、矮化和肝脏发黄、出血及针尖状坏死;且GX20210126对DF-1具有良好的细胞适应性,可引起显著细胞病变。琼脂扩散试验显示,该毒株具有良好的抗原性,病毒液能与IBDV阳性血清之间形成白色沉淀线。VP2基因进化分析显示GX20210126株与国际标准超强毒株在同一个大的分支上,氨基酸序列相似性在86.8%~99.6%之间,其中与UK661株相似性最高,为99.6%,仅有2处氨基酸位点发生改变,即D279N和I272T。以EID₅₀为10^-3.8/0.1 mL,0.5 mL/只的剂量点眼、滴鼻接种8日龄SPF鸡,攻毒后鸡出现羽毛蓬松、精神萎靡、拉白绿色水样粪便等临床症状,剖检可见肌肉、肝脏出血,肾脏尿酸盐沉积,法氏囊萎缩,IBDV拷贝数在感染后第5天达到峰值。【结论】 IBDV广西流行株GX20210126具有超强毒株基因序列特征,人工感染鸡群可导致IBDV典型临床症状和病理变化。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

DNA免疫诱导SPF鸡对传染性法氏囊病的免疫保护反应

传染性法氏囊病病毒（IBDV）D78株VP2基因插入真核表达质粒pCI CMV启动子下游多克隆位点，构成pCIVP2用于3周龄SPF雏鸡DNA免疫。试验鸡每羽腿部肌肉注射pCI VP2 100μg，2周后加强免疫一次；二免2周后，人工感染vvIBDV G株。结果，两次免疫后血清中和抗体试验组为阳性而对照组为阴性；试验组攻毒后发病11／11，攻毒后1周存活10／11，所有存活鸡法氏囊较正常中度或轻度萎缩；对照组发病6／6，病死5／6，存活1／6；存活鸡法氏囊较正常严重萎缩。组织病理学观察表明，无论法氏囊淋巴滤面积还是其中的淋巴细胞数量，免疫试验组都要远远大于或多于免疫对照组。结果表明，VP2基因DNA免疫可诱导SPF鸡产生和中抗体，并形成对IBDV超强株致死攻击的免疫保护，虽不能阻止临床发病及法氏囊病理损伤发生，但有可能减缓法氏囊病理损伤程度。     

不同传染性法氏囊病病毒分离株VP2基因部分核酸序列及其编码蛋白的比较

根据已报告的传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列,在病毒 Ｖ Ｐ２ 区域,设计 １ 对引物,并在 ２ 引物上分别加 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ酶切位点。对 ２ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 分离株 Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４,用异硫氰酸胍酚氯仿抽提一步法提取病毒 Ｒ Ｎ Ａ,然后进行逆转录和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增片段经酶切纯化后克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中,以双脱氧链末端终止法测定 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 序列。将测定的分离株与标准对照株（ Ｓ１） Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ Ｖ Ｐ２ 基因片段的核苷酸序列进行计算机分析比较, Ｊ Ｓ３ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ３ 与 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９９％ 。推导编码蛋白氨基酸序列, Ｊ Ｓ３ 和 Ｓ１ 的同源性为 ９７％ , Ｊ Ｓ４ 与 Ｓ１ 的同源性为 ９６％ , Ｊ Ｓ３ 和 Ｊ Ｓ４ 的同源性为 ９８％ 。这表明在我国流行的 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 毒株与标准毒株相比不仅在免疫学反应上有差异,而且在病毒核酸序列上有变异,这种变异是造成疫苗免疫失败或免疫逃避的分子基础。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1461bp的VP2基因，将其克隆于pET-28a载体，筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导，在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku的蛋白，SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示，VP2表达产物以包涵体形式存在，可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性，用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测，结果，复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍；用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA，结果显示，VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3c7反应强（＋＋＋）；与4E4、1H11反应中度（＋＋）；与4E5、3C4、1E11、3H9反应较弱；而与EC6、3D12、1A1无反应。     

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能研究

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本研究根据已发表的鸡源补体C3d序列,设计并合成在5’端添加编码连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有3拷贝C3d与VP2基因融合的重组表达质粒pcDNA-VP2-3C3d。用脂质体法转染BHK21细胞,48 h后,westernblot分析表明,表达的重组蛋白为162 ku;间接免疫荧光试验检测转染细胞中具有特异性荧光。用pcDNA-VP2-3C3d与前期构建的pcDNA-VP2分别免疫2周龄SPF鸡,二免14 d后,间接ELISA法检测IBDV抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d组抗体水平显著高于pcDNA-VP2组;MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,pcDNA-VP2-3C3d组免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性显著高于pcDNA-VP2组(p<0.05)。本研究表明C3d可以增强VP2基因免疫诱导的IBDV特异性体液和细胞免疫应答。     

传染性法氏囊病病毒株VP2基因在重组腺病毒中的表达

用RT-PCR方法从传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织AH1与AH2中扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析结果显示,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1350nt,编码450aa,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.2%、99.3%,七肽基序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。进一步将VP2基因克隆入人5型腺病毒穿梭载体(pShuttle-CMV),与腺病毒骨架载体(pAdEasyTM)共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组并转染HEK-293A细胞,经多次亚克隆获得了重组腺病毒rAd-(IBDV)VP2。利用Western-blot、IFA等方法检测IBDVVP2蛋白的体外表达情况,结果证明VP2基因在腺病毒中获得了表达。     

鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因在杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性研究

将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

Reduction of infectious bursal disease virus replication by shRNAs targeting the VP1 and VP2 genes driven by chicken U6 promoter

Infectious bursal disease virus (IBDV) causes a highly contagious and immunosuppressive disease in young chickens and results in considerable economic losses for the poultry industry. To suppress the replication of IBDV, two short hairpin RNAs (shRNAs) were designed for targeting the VP1 and VP2 genes of IBDV. Recombinant plasmids carrying each shRNA or two shRNAs were constructed based on vector pSilencer2.1-U6 in which the human U6 promoter was replaced with chicken U6 promoter. In chicken embryo fibroblasts, transfection with these shRNA plasmids 24 h before infection with IBDV B87 reduced 50% tissue culture infectious doses (TCID₅₀) from 10^8.75 TCID₅₀/0.1 mL to 10^3.75–10^1.0 TCID₅₀/0.1 mL. In 10-day old specific pathogen-free (SPF) chicken embryos, incubation with a mixture of IBDV B87 and a shRNA plasmid via the allantoic cavity resulted in 100% mortality and high IBDV virus titer in the control group but 25–0% mortality and near normal embryo development in the specific shRNA groups; additionally, IBDV VP1 and VP2 mRNA levels were reduced by 72–95% in the shRNA groups as compared with the control groups. When challenged with a virulent strain IBDV GX8/99, 14-day-old chickens pre-treated with the single shRNA plasmids or the dual shRNA plasmid showed approximately 70% or 90% survival at 5 days post-challenge while those pre-treated with control plasmid or saline had less than 5% survival. The current study suggests that two IBDV shRNAs expressed by a plasmid under chicken U6 promoter could effectively and synergistically reduce IBDV replication in vitro and in vivo.     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。