禽腺病毒4型抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种快速检测鸡群中禽腺病毒4型(FAd V-4)的血清学方法,本研究利用纯化的FAd V-4中国流行株作为包被抗原,并对各反应条件进行优化,建立了检测FAd V-4血清抗体的间接ELISA方法。FAd V-4抗原与抗新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清均无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性;批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.735%和4.373%,显示该方法具有较好的稳定性;利用所建立的ELISA方法对40份来自疑似FAd V-4感染病鸡的血清样品进行检测,检测结果与FAd V-4 PCR检测结果符合率为100%。对我国河南、山东、安徽、山西和江苏等不同地区的676份鸡血清样品进行了FAd V-4流行病学调查,结果显示上述省份均存在不同程度的FAd V-4感染,抗体阳性率在69.3%~89.1%。表明该方法为FAd V-4流行病学调查和防控提供了一种快速有效的检测方法。     

基于血清4型禽腺病毒fiber-1蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了获得血清4型禽腺病毒(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)fiber-1重组表达蛋白,并建立快速鉴别检测方法,本试验将FAdV-4 fiber-1基因连入pET-32a表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,将测序正确的重组蛋白经IPTG诱导表达、纯化和Western blot鉴定。以纯化的pET-32a-fiber-1重组蛋白作为ELISA包被抗原,优化反应条件,建立了检测FAdV-4抗体的fiber-1-ELISA方法。结果成功表达pET-32a-fiber-1蛋白,证实可与FAdV-4阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。特异性结果显示,除FAdV-4与FAdV-10外,与其他病原的抗体无交叉反应;阳性血清稀释1 600倍仍可检测到,批内和批间最大变异系数均小于10%。检测了176份临床样品,75份为阳性,101份为阴性。fiber-1-ELISA方法易于操作,特异性强,重复性好,为FAdV-4抗体监测提供了有效方法。     

禽腺病毒1型抗体间接ELISA检测方法的建立

采用过滤法及蔗糖梯度密度离心法制备禽腺病毒1型(FAV-1),以FAV-1全病毒作为ELISA包被抗原,对ELISA的反应条件进行摸索,建立了2种检测FAV-1抗体的ELISA检测方法。2种ELISA检测方法特异性强,对禽流感病毒、新城疫病毒及禽呼肠孤病毒阳性血清的检测结果均为阴性;重复性好,重复试验变异系数均小于5%。应用建立的ELISA检测方法,对FAV-1灭活疫苗免疫后的抗体水平进行监测,2种方法均能反映抗体水平的消长。结果表明,本研究建立的ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4) Fiber-2蛋白免疫原性

2015年以来由高致病性血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起的疾病给我国养鸡业造成巨大的经济损失,研发安全高效的疫苗成为当务之急。本研究将FAdV-4 W株Fiber-2基因克隆到原核表达载体pET-32a上,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,利用亲和层析柱纯化重组Fiber-2蛋白;将纯化的Fiber-2蛋白制成油乳疫苗免疫3周龄SPF鸡,免疫后3周用W株攻毒,通过死亡率和泄殖腔排毒来评价保护效果。结果显示,Fiber-2基因原核表达获得大小约89 000的重组蛋白;用Fiber-2蛋白(≥1.0μg/只)免疫能够有效保护鸡免受FAdV-4攻击,FAdV-4的Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗具有良好的免疫保护效果。     

I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立I群禽腺病毒4型血清学检测方法,本研究利用纯化的I群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法。结果显示,抗原最佳包被浓度为1 μg/mL;最佳封闭液为1%牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60min;最佳显色时间为10min。用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测。     

Ⅰ群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

利用纯化的 Ⅰ 群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了 Ⅰ 群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法.结果显示,抗原最佳包被浓度为1μg/mL;最佳封闭液为1% 牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60 min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60 min;最佳显色时间为10 min.用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测.     

4型禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

以4型禽腺病毒(FAdV-4)的DNA为模板,扩增其六邻体(hexon)部分基因并进行重组表达,以重组hexon蛋白为包被抗原,优化ELISA检测条件,建立了FAdV-4的ELISA抗体检测方法。该方法对FAdV-4阳性血清检测为阳性,对于其他鸡常见病毒,如禽流感病毒5、7、9型,新城疫病毒以及鸡传染性支气管炎病毒阳性血清检测均为阴性;与PCR方法的阳性符合率为83.3%。试验表明,建立的以重组hexon蛋白为包被抗原检测FAdV-4血清抗体的ELISA方法可以用于检测FAdV-4的感染及相关流行病学调查。     

禽腺病毒血清4型Fiber-2蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其免疫原性分析

旨在解决大肠杆菌表达系统对禽腺病毒血清4型(FAdV-4)Fiber-2蛋白进行表达时存在的多包涵体问题.通过添加不同的化学伴侣分子来提升Fiber-2的可溶性表达量,并进一步通过动物试验评价蛋白的免疫原性.结果 显示,添加化学伴侣分子p-环糊精显著提高了Fiber-2的可溶性表达量,且重组蛋白与FAdV-4阳性血清具...     

禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立

为了建立一种快速、灵敏、简便的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)现场检测方法,本试验将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAdV-4hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5′端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25～45℃恒温反应15 min即可实现对FAdV-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本试验建立的RPA-LFD可用于FAdV-4的临床快速检测,为FAdV-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。     

禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白的原核表达与间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立禽腺病毒4型(FAdV-4)特异性抗体检测方法,将密码子优化合成的FAdV-4中国流行株Fiber2蛋白的编码基因克隆于pET-32a(+)载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。用纯化的Fiber2蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化,建立了一种检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法。结果:该方法可以特异地检测抗FAdV-4抗体,与新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、H5和H9亚型禽流感病毒等常见禽病毒的抗血清均无交叉反应,表明所建立ELISA具有较好的特异性;FAdV-4阳性血清经1?3 200稀释后检测结果仍为阳性,表明所建立ELISA方法具有较高的敏感性;所建立ELISA的批内和批间重复试验的变异系数分别为1.5%～5.2%和1.1%～5.6%,表明其重复性良好。应用建立的ELISA方法对河南省及周边部分地区养禽场内FAdV-4的感染情况进行了血清流行病学调查,结果显示被检地区养禽场均存在不同程度的FAdV-4型抗体阳性,平均阳性率为59.53%。由此表明本研究所建立的ELISA方法可以用于FAdV-4感染的监测和流行病学调查。     

血清4型禽腺病毒研究进展

近年来,血清4型禽腺病毒（FAdV-4）在我国爆发,造成家禽行业严重的经济损失。病毒感染引起死亡率高,临床剖检可见明显的心包积液综合征的症状。病毒极具传染性,可垂直及水平传播,通过受感染肝脏组织匀浆可以分离和检测病毒。目前实验室诊断主要通过琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验、限制酶分析、聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、高分辨率的融化曲线分析等进行检测。疾病预防主要通过灭活疫苗的接种,而减毒活疫苗和亚单位疫苗也相继被开发。对FAdV-4的流行病学、发病特征、病毒诊断方法以及预防策略等方面进行了综述,以期为FAdV-4的深入研究奠定基础。     

血清4型禽腺病毒研究进展

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是引起心包积液-肝炎综合征(Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis,HPS-IBH)的主要病原。HPS-IBH在多个国家均有报道;2015年6月在我国暴发,主要危害鸡,尤其是3~7周龄肉鸡,已成为危害我国养禽业的主要疫病之一。随着HPS-IBH疫病严重程度的增加,国内外对该病的重视程度也不断增加。近年来,在该病的诊断技术、疫苗和防控技术等领域的研究都取得了一定的进展,为更加全面地了解该病最新研究成果,文章对FAdV-4近年来取得的研究结果进行综述,以期为该病防控提供技术资料。     

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。     

Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。     

血清4型禽腺病毒的实验室诊断方法研究进展

自2015年来,我国河南、山东、广东等地许多集约化家禽养殖地区均有血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染导致的心包积液综合征暴发,患病鸡死亡率较高,严重制约了我国家禽业的可持续发展。然而,目前对FAdV-4的分子流行病学和致病机制所知甚少,且国内尚无获批的商品化疫苗,给该病的防控造成了困难。本文对近年来FAdV-4的实验室诊断方法的研究进展进行了综述,以期为我国新发FAdV-4的防控提供理论依据和技术支撑。     

间接ELISA检测禽霍乱抗体方法的建立

用多杀性巴氏杆菌 TJ8菌株制备ELISA抗原 ,与抗鸡 Ig单抗 1 B7酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接 ELISA方法。交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强 ,灵敏度高。确立了将鸡血清 1 0 0倍稀释监测 ELISA效价(ET)的回归方程 y=1 .4981 + 0 .391 9x(P>0 .0 5 ) ,可用于定量测定。间接凝集试验与ELISA方法的比较试验表明 ,EL ISA法比间接血凝试验敏感性高 4倍以上     

禽腺病毒血清4型纳米PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速有效检测禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的方法,本研究根据FAdV-4五邻体(Penton)基因序列,设计合成1对特异性引物,经过条件优化,建立了检测FAdV-4的纳米PCR方法(Nano PCR)。特异性试验结果显示,该方法对鸡新城疫病毒等12种家禽常见病原及国内报导的FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11等5个主要血清型病毒的扩增结果均为阴性,仅FAdV-4检测结果为阳性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对FAdV-4的最低核酸检出量为54.0拷贝/μL,较常规PCR方法高10倍,敏感性较高。应用该方法和病毒分离培养法同时对87份临床样品进行检测,二者均检出14份阳性样品,总体符合率为100%。以上结果表明本研究建立的Nano PCR方法特异性好、敏感性高,可以用于FAdV-4的临床检测和分子流行病学调查。     

血清4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速有效的检测血清4型禽腺病毒,本试验针对高度保守的Hexon基因序列设计引物和探针,建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,结果显示:该方法线性关系良好,R~2=0.998;特异性强,对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)均无扩增;敏感性好,最低可检测病毒含量为50拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;稳定性良好,组内和组间重复试验的变异系数分别为0.75%～1.71%和0.60%～1.74%。本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法,为血清4型禽腺病毒感染临床快速、准确诊断提供了技术支撑。     

1群4型禽腺病毒的分离鉴定及Fiber-2蛋白的免疫效果分析

旨在鉴定河南某蛋鸡场以心包积液、肝肿大出血为特征的病原,并对病原的免疫原性蛋白进行表达和效果分析。本研究采用病毒分离、血清学试验、PCR检测及测序分析、动物回归试验、大肠杆菌表达、蛋白纯化、攻毒保护等方法进行研究。结果显示,所采集样品经卵黄囊途径接种7日龄SPF鸡胚,盲传2代后获得病毒;PCR可扩增出约900 bp的Hexon基因片段,经测序,其Hexon基因与血清C4型毒株的相似性为100%;血清中和试验结果表明分离的禽腺病毒为1群血清4型禽腺病毒,命名为HN-ZK株。该毒株可在鸡胚原代肝细胞上产生CPE,病毒含量可达10^7.5TCID₅₀·0.1 mL^-1。动物回归试验表明,该分离毒株可使35日龄SPF鸡100%（10/10）表现出发病症状。以分离株的DNA为模板,利用大肠杆菌原核表达系统,获得相对分子质量约为33 ku的Fiber-2蛋白,离心浓缩、纯化后蛋白含量为300 mg·mL^-1。将表达的Fiber-2蛋白用不同的剂量免疫SPF鸡,结果表明20 μg·只^-1的剂量能使鸡完全抵抗强毒株的攻击,说明Fiber-2蛋白具有较好的免疫原性。本研究可为禽心包积水-肝炎综合征的诊断和基因工程亚单位疫苗的研制提供数据参考。     

猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立

为了猪圆环病毒2型（PCV2）抗体,该研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,