PEDV、TGEV和PRoV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）的快速鉴别检测方法,本试验针对PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计3对特异性引物PEDV-N、TGEV-M和PRoV-VP6,分别扩增PEDV N基因、TGEV M基因和PRoV VP6基因。经优化反应条件,成功建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR方法。该方法可特异扩增PEDV、TGEV、PRoV相应的基因片段,而与猪瘟病毒（CSFV）、猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2型（PCV2）均无交叉反应;对PEDV、TGEV、PRoV基因重组质粒标准品的检出限分别为1.41×10³、1.41×10²和1.41×10³拷贝/μL;在相同条件下重复试验可获得一致的结果。应用该方法对临床采集的190份腹泻病料进行检测,结果PEDV阳性42份,阳性率22.11%;TGEV阳性58份,阳性率30.53%;PRoV阳性34份,阳性率17.89%,且存在不同病毒混合感染的现象。结果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,可用于PEDV、TGEV和PRoV的临床检测和流行病学调查。     

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10³,1.13×10³,1.31×10²和1.18×10^2<...     

PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪轮状病毒(RV)引起的猪腹泻病,通过设计三对引物,建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感,能同时检测PEDV、TGEV、RV,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增,检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测,PEDV阳性率占37.5%,TGEV阳性率占0.75%,RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明,与近几年分离毒株亲缘关系较近,与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高,能用于临床诊断及流行病学调查。     

PEDV、TGEV、PoRV和PKV多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为快速鉴别诊断猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪嵴病毒(PKV),根据PEDV的M基因、TGEV的N基因、PoRV的VP6基因和PKV的3D基因序列设计4对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测4种病毒的RT-PCR诊断方法,该方法可特异性扩增这4种病毒的相应片段,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)均无扩增,最低检出量分别为1.33×10^4、1.33×10^3、1.33×10^4、1.33×10^5copies/μL。应用该方法对临床55份猪腹泻样品进行检测,结果检测出14份PEDV、1份PoRV和27份PKV,未检出TGEV,其中PEDV和PKV混合感染9份。上述结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于以上4种腹泻病毒的临床检测和流行病学调查。     

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10²、10²、10³、10³ TCID₅₀/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10¹、10²、10²、10^2<...     

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）与传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R_（P）²=0.9994和R_（T）²=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1 000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数（CV）均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%（6/114）和8.8%（10/114）,混合感染检出率为4.6%（5/114）,比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S基因序列和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因序列,设计特异性的引物和探针。通过对引物和探针浓度等反应液用量以及反应条件等因素进行优化试验,建立了能同时鉴别检测TGEV和PEDV的二重荧光RT-PCR方法。用该方法同时检测其他病原如Po RV、PCV和CSFV时不发生交叉反应,特异性好;较普通PCR均高出3个数量级的敏感性,能够检测10 TGEV和10 PEDV拷贝数,敏感性高;组内重复和组间重复试验结果变异系数小,稳定性好;同时检测2个模板的不同浓度组合试验,干扰性小。本试验建立的二重荧光RT-PCR方法可用于TGEV和PEDV的鉴别检测,且具有特异、敏感、稳定、快速等优点,为进一步应用于TGEV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。     

TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2％,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92％,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。     

实时荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立及应用

本研究将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒,以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线,建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对20份临床疑似病料进行检测,发现14份为荧光定量RT-PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出10份。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detection of PEDV,TGEV and PRoV

In this study,a multiplex RT-PCR assay was established to differentially detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PRoV) after optimization of the reaction conditions.Three pairs of primers PEDV-N,TGEV-M and PRoV-VP6 were designed for specifically amplifying PEDV N gene,TGEV M gene and PRoV VP6 gene,respectively.The assay could specifically amplify PEDV,TGEV and PRoV,but not classical swine fever virus (CSFV),porcine foot and mouth disease virus (FMDV),pseudorabies virus (PRV),porcine parvovirus (PPV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).The detection limits of PEDV,TGEV and PRoV standard recombinant plasmids were 1.41×10³,1.41×10² and 1.41×10³ copies/μL,respectively.The repeated reaction under the same conditions obtained uniform results.The assay was used to detect a total number of 190 clinical samples,of which 42 (22.11%) samples were positive for PEDV,58 (30.53%) samples for TGEV and 34 (17.89%) samples for PRoV,and there were mixed infection among these viruses.The results indicated that this multiplex RT-PCR assay had the advantages of sensitivity,specificity and repeatability and provided a useful tool for differential detection and epidemiological investigation of PEDV,TGEV and PRoV.     

Establishment and Application of a Double RT-PCR Method for Detection of PEDV and TGEV

The study was aimed to establish a rapid one-step duplex RT-PCR detection method,which could be used to identify and diagnose PEDV and TGEV in clinical diarrhea cases.According to the gene sequences of PEDV and TGEV from GenBank,two pairs of specific primes were designed.Through optimizing and selecting of the best reaction conditions,we finally pinpointed the duplex one-step RT-PCR detection method with strong specificity,which could detect 1×10^-5 diluent degree of vaccine. Suspected samples,which were collected from different pig farms in 2015,were detected of PEDV with 100% positive rate.The method was rapid,high sensitivity and specificity,which could be used for clinical detection of PEDV and TGEV,and also for epidemiological investigation.     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10^-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。     

3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测

试验建立了用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪轮状病毒(PRV)的三重RT-PCR方法,以调查猪群中腹泻病毒感染情况.通过该方法对采自广东省规模化猪场的95份临床疑似病毒性腹泻病料进行了检测,结果表明,猪流行性性腹泻病毒阳性率为33.7%,猪传染性胃肠炎病毒阳性率为4.2%,猪轮状病毒阳性率为20%;猪流行性性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染率为8.4%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染率为2.1%.     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

检测猪传染性胃肠炎病毒Taq Man荧光定量RT-PCR方法的建立与初步应用

据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因的保守区序列设计合成了引物和探针,对荧光定量RT-PCR的反应条件进行了优化,建立了一种特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量RT-PCR方法来检测TGEV。与国外进口的An imal Genetics公司生产TGEV抗原快速检测试剂盒进行比较,符合率达到100%;与常规RT-PCR检测方法相比,灵敏度高100倍。用该方法对辽宁、山东、福建等地的送检疑似病料进行了检测,结果阳性率为24%。试验证明,所建立方法适用于猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断、流行病学调查等相关研究。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪呼吸道冠状病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法建立与应用

本研究根据Genbank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和S基因保守区序列设计合成了两对引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测TGEV的方法。该方法能有效地鉴别序列密切相关的猪传染性胃肠炎病毒与呼吸道冠状病毒。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3个小时以内,具有很好的特异性和重复性。通过对39份临床样品进行检测,结果表明所建立的检测方法直接检测样品中猪传染性胃肠炎病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二重PCR检测方法的建立

通过对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因和猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因进行序列分析,本试验利用DNAStar软件分别设计2对特异性引物,扩增片段长度分别为299和437 bp,建立一种针对TGEV和PEDV感染的二重PCR鉴别诊断方法.该方法能同时检测到TGEV和PEDV,而对猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等均无扩增,其检测TGEV、PEDV的极限为10⁴ 拷贝/μL;用该方法对临床收集的68份疑似病毒性腹泻仔猪粪便和肠道组织样本进行检测,结果表明本试验建立的二重PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点,能用于临床诊断及流行病学调查.     

The Prevalence and Prevention of PEDV,TGEV and PoRV in Porcine Viral Diarrhea

PEDV,TGEV and PoRV are the main pathogenies of porcine viral diarrhea that endanger the healthy development of swine industry,which are characterized by vomiting,severe diarrhea and dehydration, the morbidity and mortality of suckling piglets is higher,and the incidence of diarrhea is lower in replacement gilts,sows or fattening pigs. Especially since 2010, the prevalence of PEDV mutant strains has had a serious impact on the global swine industry,but the control measures can not been able to cope with the new epidemic situation. In recent years, many new techniques or methods have been applied to the control of swine viral diarrhea caused by PEDV, TGEV and PoRV. Based on the analysis of genetic variation and epidemic status of three kinds of viruses,this paper reviewed the prevention and control measures from the aspects of feeding management,immunization prevention, traditional Chinese medicine therapy,interference therapy,specific therapy and return therapy.