犬心丝虫内共生体-沃尔巴克氏体DNA检测

通过检测犬血液中心丝虫共生体-沃尔巴克氏体DNA,了解海南海口犬心丝虫的自然感染及沃尔巴克氏体的基因分型情况。随机以海南流浪狗中心和海口市宠物医院的60只家犬作为指示动物,使用真空采血管抽取家犬全血,应用PCR扩增犬血中犬心丝虫沃尔巴克氏体丝状热敏感蛋白基因(fts Z基因)片段以检测心丝虫感染犬外周血液中的沃尔巴克氏体DNA,然后对阳性片段进行测序,并将所测序列与Gen Bank中注册的基因序列进行比较分析。结果显示,共检测60只家犬血液,其中发现3只犬为心丝虫沃尔巴克氏体阳性,阳性率5.0%。系统发育树对比结果显示,海口犬源犬恶丝虫沃尔巴克氏体与来自中国成都犬恶丝虫沃尔巴克氏体的fts Z基因序列的同源性最高。同时,显示不同宿主和不同地区的犬恶丝虫沃尔巴克氏体形成一个支系。     

猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。     

检测犬恶丝虫病免疫层析试纸条的研制

以胶体金标SPA和犬恶丝虫抗原蛋白制备免疫层析试纸条,对300份犬血清进行检测,阳性检出率高达5.0%,同时用虫检法检测犬恶丝虫感染率,阳性检出率为4.0%。结果提示免疫层析试纸条具有操作简便、灵敏度高、特异性强的优点,可用于犬恶丝虫病的快速检测。     

山羊痘病毒G9蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

山羊痘病毒(GTPV)G9是一种膜蛋白,是潜在的优势抗原,为建立检测山羊痘的间接ELISA方法,本研究克隆GTPV G9基因并原核表达了重组G9蛋白,利用该蛋白作为包被抗原,经各反应条件优化建立了检测GTPV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估.结果显示,原核表达的重组G9蛋白约为39...     

肝片吸虫MeCatL-B融合基因的构建、表达及其间接ELISA检测方法的建立

为分析组织蛋白酶的抗原性及评价其作为肝片吸虫(Fh) ELISA诊断抗原的潜力,本研究采用RT-PCR技术扩增FhCatL1D和CatB4基因的优势抗原表位集中区段,利用重叠延伸PCR技术融合CatL1D和CatB4基因片段获得约810 bp的Fh CatL-B融合基因(MeCatL-B),构建原核重组表达载体pET-MeCatL-B,并将其转化入BL21 (DE3)感受态细胞中诱导表达,经SDS-PAGE和western blot检测,结果显示表达的重组蛋白MeCatL-B (rMeCatL-B)约46 ku,可以被Fh阳性血清特异性识别。以纯化的rMeCatL-B为包被抗原,经优化各反应条件后建立检测Fh抗体的间接ELISA方法,该检测方法的特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法对97份绵羊临床血清样品进行检测,并与商品化FhELISA抗体试剂盒检测结果对比,结果显示二者符合率达95.88%。本研究为进一步研发Fh血清学诊断试剂盒奠定了前期基础。     

犬血丝虫病诊疗病例

犬血丝虫病是由犬血丝虫寄生于犬类动物右心室或肺动脉引起的犬类动物的一种重要的寄生虫病,以循环障碍、呼吸困难、贫血为主要特征。犬血丝虫又叫犬心丝虫或犬恶丝虫,犬为其终末宿主,蚊、蚤等吸血昆虫是中间宿主。当寄生的虫体影响心脏器质功能（比如三尖瓣或肺动脉瓣功能不全）时,患犬会出现呼吸困难、胸腹水、下体浮肿等较为严重的临床症状,甚至发生急性死亡。诊断本病以外周血中查到犬血丝虫的幼虫微丝蚴为主。治疗本病则以驱虫为主,补血、输液等对症治疗作为辅助措施。     

基于马梨形虫地方虫株EMA和Bc48基因蛋白抗原的间接ELISA检测方法建立及其应用

以筛选马梨形虫地方虫株EMA和Bc48基因最佳抗原蛋白建立间接ELISA检测方法及其临床应用研究为目的,对已构建保存的pGEX4T-1/EMA1、PET-28a/EMA1、PET-28a/EMA2、PET-28a/EMA3、pGEX4T-1/Bc48和PET-28a/Bc48质粒进行优化表达,经KCl方法切胶纯化后作为间接ELISA包被抗原,经表达量、特异性、敏感性、重复性、符合性试验验证,筛选最佳重组抗原蛋白,优化、建立间接ELISA检测方法,并用于临床样品(n=1 584)的抗体检测。结果显示,筛选出的最佳重组抗原蛋白为GST-EMA1和His-Bc48,其可溶性蛋白表达量相比之下较高;以GST-EMA1、His-Bc48蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA可明显区分马梨形虫标准阴性和阳性血清;阳性血清梯度效价可达1∶800;批内重复率分别为96%和94%;与商品化cELISA试剂盒检测结果的符合率为96%。所检测的血清样品中,新疆昭苏、米泉、富蕴、阿克苏及和静样品混合感染率分别为2.27%,6.90%,1.72%,0.74%和1.18%;不同年龄马匹之间感染存在显著性差异(P=0.0000.05)。试验筛选出GST-EMA1、His-Bc48为最佳抗原蛋白,经临床试验验证所建立间接ELISA检测方法的特异性强和灵敏度高,为后期马梨形虫病血清学诊断用间接ELISA商品化试剂盒研制提供实验材料和技术支持。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

参照IBV S1基因序列,RT-PCR扩增长约867bp的S1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆到pET30α原核表达载体,转化Rossetta表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组S1蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的免疫活性。以该蛋白作为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗体的间接ELISA检测方法。该方法与其他6种常见禽病病毒(H5亚型禽流感病毒(H5-AIV)、H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDSV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡法氏囊病毒(IBDV))阳性血清不发生交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;相对于HI试验的符合率、敏感性、特异性分别为91.58%、91.24%和92.31%;相对于IDEXX ELISA的符合率、敏感性、特异性分别为94.55%、95.42%和92.96%;应用该方法检测山东及周边地区2 685份免疫鸡和168份未免疫鸡血清样品,免疫合格率和阳性感染率分别为85.25%和17.26%。本试验截短表达的S1蛋白具有良好的免疫活性,建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性、特异性、重复性和临床适用性,将为IBV的免疫抗体监测、临床野毒感染快速诊断和流行病学调查提供了一种新的血清学诊断技术,具有良好的推广应用前景。     

基于血清4型禽腺病毒Fiber-2间接ELISA方法的建立

为建立一种快速监测鸡群中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的方法,本研究通过PCR扩增FAd V-4 AQ强毒株的fiber-2基因截短体(112 bp～1 440 bp),克隆至p ET-32a(+)载体中进行原核表达,以重组表达的Fiber-2蛋白作为包被抗原,经优化反应条件,建立了快速检测FAd V-4的间接ELISA方法,该方法特异性试验结果显示,除FAd V-4外,与其它病原无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法检测血清最低稀释度为1∶12 800,具有较高的敏感性;重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。该方法对FAd V-4临床感染的阳性血清检出率为100%,与琼脂扩散试验结果完全吻合。本研究建立的以Fiber-2重组蛋白为包被抗原的间接ELISA方法能够用于FAd V-4灭活疫苗免疫后的血清学调查。     

基于A型塞尼卡病毒结构蛋白VP1间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,初步建立了SVA的间接ELISA抗体检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测;利用该方法对43份背景清晰的猪血清进行检测,并与中和试验结果进行比较;同时对205份临床猪血清样品进行检测。结果显示,本研究正确表达了约51.0 ku的可溶性重组蛋白,western blot试验表明纯化的r VP1蛋白具有良好的反应原性,以r VP1蛋白建立了间接ELISA方法。特异性试验结果显示该ELISA方法可以检测SVA抗体,而与FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、PRRSV、PRV等病原的抗血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示样品经1∶800倍稀释后折OD450nm值仍大于临界值;批内、批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床猪血清样品的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段。     

中西医结合防治犬恶丝虫病

<正>犬恶丝虫病又称恶心丝虫病、犬血丝虫病,是由双瓣科恶丝虫属的犬丝虫寄生于犬的右心室和肺动脉所引起的一种丝虫病。临床主要为血液循环障碍、呼吸困难、贫血、皮肤有结节等症状。猫、狐、狼、猩猩及人体也可感染。1犬恶丝虫生活史犬恶丝虫是一种微白色细长的线虫。犬恶丝虫需要蚊虫作为中间宿主,其幼虫微丝蚴,也可在猫蚤与犬蚤体内发育。成熟雌虫产生微丝蚴,后者进入宿主的血液循环系统。蚊虫吸血时,微丝蚴随血液进入蚊体内,2周内发育为     

犬瘟热病毒重组H蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测水貂犬瘟热病毒(CDV)血清抗体的间接ELISA方法,将CDV的血凝素蛋白(H)基因的主要抗原表位片段克隆至p ET-30a-c(+)载体中,转化至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。以纯化的重组H蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法,并证实该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。采用建立的方法与国外商品化的犬瘟热抗体检测试剂盒对80份血清进行检测,两者符合率为92.5%。本研究建立的间接ELISA方法为水貂抗体水平检测和评价犬瘟热疫苗免疫效力提供了简便快速的方法。     

猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪丹毒杆菌血清抗体的ELISA方法,本研究将猪丹毒杆菌(1a型)云南分离株ZY15074的超声裂解的全菌蛋白作为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法。特异性试验结果显示该方法与猪其它10种常见病原阳性血清均无交叉反应。该方法对阳性血清的敏感性为1/256。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于10%。对160份临床血清样品比对试验结果显示该方法与国外间接ELISA方法的符合率为90.6%。本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可以用于猪丹毒杆菌血清抗体检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。     

犬弓形虫抗体间接ELISA检测方法的建立

试验以利用重组弓形虫SAG1基因转染蜥蜴利什曼原虫所表达获得的目的蛋白作为包被抗原,建立了一种快速、特异、可检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为6.75 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,对已知阳性血清检测的下限可达1∶6400,批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,包被抗原的酶标板在4、-20 ℃环境中可保存8个月以上。建立的间接ELISA方法应用于犬弓形虫抗体的检测具有较好的敏感性及特异性。     

犬恶丝虫抗体dot-ELISA检测方法的建立

为快速诊断犬恶丝虫病，建立了犬恶丝虫抗体dot—ELISA检测方法，并与阻断试验、交叉反应试验、重复性试验、琼脂扩散试验和平行对照试验进行了比较。结果显示，制备的犬恶丝虫虫体粗制抗原与犬钩虫、犬弓首蛔虫和犬蠕形螨感染犬的阳性血清无交叉反应，检出犬恶丝虫阳性血清的最高抗体效价为1：1024，重复性好；建立的犬恶丝虫病dot—ELISA诊断方法的灵敏度比琼脂扩散试验和美国IDEXX实验室制备的犬恶丝虫病诊断试剂盒分别高2048倍和48倍。     

基于3种抗原的融合表达蛋白建立牛分枝杆菌抗体ELISA检测方法

为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示：通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV GP5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中构建原核重组表达载体p GEX-6P-GP5,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以梯度尿素法对表达蛋白纯化后,以其为包被抗原,利用方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了GP5蛋白的最佳包被浓度是150 ng/孔,被检血清的最佳稀释倍数为80倍。试验结果显示,该检测方法的特异性、敏感性、重复性很强。从山东各地采集203份猪血清样品进行检测,结果显示该检测方法与商品化PRRSV抗体检测试剂盒(法国LSI)检测结果的符合率为96.5%。本研究建立的间接ELISA方法,为猪群体内PRRSV抗体水平的检测提供了重要的检测手段,在疫苗免疫效果的评价方面有着广泛的应用。     

佐剂对两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫影响的研究

在寄生虫感染过程中,丝氨酸蛋白酶抑制剂在虫体与宿主相互作用间发挥着重要作用。在免疫过程中,不同佐剂的促免疫应答能力和提高免疫保护能力均不同。为了比较不同佐剂对两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsAdSPI和TsKaSPI)免疫保护性的影响,通过对免疫剂量进行优化,应用间接ELISA的方法分析两种SPIs抗体应答,分别在肌肉虫攻击感染后第1天、第3天、第7天、第10天剖杀小鼠取成虫并计数,计算成虫减虫率。结果显示,用3种不同剂量(20、50μg和100μg)的重组蛋白免疫小鼠,50μg与100μg蛋白剂量免疫组诱导产生类似的抗体水平,且均高于20μg组;免疫组弗氏佐剂、ISA 206佐剂和铝佐剂分别与重组蛋白乳化后免疫,可诱导相似的免疫应答及成虫减虫率,其中佐剂ISA 206和氢氧化铝的保护效果更好。     

细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。