抑制伪狂犬病病毒复制的宿主蛋白的筛选与鉴定

本试验旨在利用TMT蛋白组学分析并筛选出抑制伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)复制的关键宿主蛋白。前期通过TMT定量蛋白组学技术筛选出241个差异蛋白,Western blot和RT-qPCR验证4个差异表达的蛋白,结果与蛋白组学结果一致,表明蛋白组学结果真实可信。通过构建4个差异表达蛋白的真核表达载体,Western blot、RT-qPCR、病毒噬斑结果显示这4个宿主蛋白均可抑制PRV的复制;然后通过双荧光素报告基因检测IFN-β启动子活性,结果显示,MCCC1、STRAP促进IFN-β启动子活性效果更为显著;针对MCCC1和STRAP设计siRNA,Western blot和病毒噬斑结果显示,敲低STRAP显著促进PRV的复制。本试验最终筛选出显著影响PRV复制的宿主蛋白STRAP,为研究PRV与宿主互作的分子机制奠定基础。     

伪狂犬病病毒研究概况

伪狂犬病病毒(PRV)在猪群中具有传播快、流行范围广、传播途径多等特点,给世界养猪业造成了巨大损失。目前,PRV的基因组测序工作已基本完成,但对其各基因功能的研究还不全面。间质蛋白和囊膜蛋白是病毒的重要组成部分,一旦缺失会严重影响病毒的生理机能,这为基因工程疫苗的制备提供了基础。随着对PRV研究的不断深入,PRV载体也成为了病毒载体研究领域的一大热点。论文对PRV的基因组结构、蛋白及其功能、复制方式等方面进行了综述,旨在为该病的诊断、免疫机理研究与疫病防控提供借鉴。     

宿主膜联蛋白A2与伪狂犬病病毒US3蛋白互作及其对细胞凋亡的影响

US3蛋白激酶是伪狂犬病病毒（PRV）的一个重要毒力因子,研究显示US3参与了细胞骨架重排、病毒复制和传播、细胞凋亡和干扰素信号通路等多个生物学过程,鉴定新的和US3互作的宿主蛋白对于认识其生物学功能具有重要意义。本研究首先利用免疫共沉淀和pull-down技术验证了US3和宿主膜联蛋白A2（ANXA2）的相互作用;然后利用RNAi技术,通过荧光定量PCR、病毒滴度测定和免疫印迹分析,发现敲低ANXA2的表达显著抑制了PRV在PK-15细胞上的增殖;进一步发现过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡,提示ANXA2具有负调控细胞凋亡的作用。本研究进一步完善了可以和US3蛋白互作的宿主蛋白成员,加深了人们对ANXA2生物学功能的理解。     

伪狂犬病病毒主要编码蛋白研究进展

本文从伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）的必需糖蛋白、非必需糖蛋白和其它主要编码蛋白及酶三个方面综述了ＰｒＶ所编码蛋白的最新研究进展。     

伪狂犬病病毒分子生物学研究新进展

近年来，随着分子生物学研究的深入，对伪狂犬病病毒的研究取得很显著的进展。本文对伪狂犬病病毒的特性，基因结构特点，病毒糖蛋白种类和作用以及伪狂犬病病的毒力因子，基因工程疫苗研究现状进行了较详细综述，对同道者研究伪狂犬病病毒有重要的指导作用。     

伪狂犬病病毒pUL34核膜定位和功能的结构性决定因素研究

疱疹病毒蛋白pUL34和pUL31在内核膜(INM)形成的复合物对于有效的核释出是必需的。伪狂犬病病毒(PRV)pUL34是含262个氨基酸(AA)的Ⅱ型膜蛋白。预测跨膜区(TM)位于245-261位,C端只有一个氨基酸,可能延伸到核周间隙。在缺失其他病毒蛋白时,其靶向核膜的固有定位基序,其结构与细胞INM蛋白,如Lap2β和Emer-in相似。为研究pUL34中与定位和功能有关的结构域,通过用细胞INM蛋白区域替换pUL34部分区域构建了嵌合蛋白。将C端18个氨基酸,包括TM替换为Lap2β和Emerin的TM和C端结构域,或核纤层蛋白B受体(LBR)的第一个TM,包括其后的9个氨基酸。所有由此产生的嵌合蛋白都弥补了PRV-ΔUL34的复制缺陷,表明TM的替代和C端结构域的扩展都不会干扰pUL34的功能。当C端50个氨基酸用相应的Lap2β序列取代(pUL34-LapCT50),其互补作用降低,但并没有阻断。然而,C端100个氨基酸(pUL34-LapCT100)替换后虽然仍能与pUL31结合,但会产生一个无功能的蛋白,说明这个区域在蛋白质功能中起着重要的作用。N端100个氨基酸(pUL34-LapNT100)的替换对核膜定位没有影响,但能阻断pUL31的结合和功能。     

伪狂犬病病毒pUL34核膜定位和功能的结构性决定因素研究

疱疹病毒蛋白pUL34和pUL31在内核膜(INM)形成的复合物对于有效的核释出是必需的。伪狂犬病病毒(PRV)pUL34是含262个氨基酸(AA)的Ⅱ型膜蛋白。预测跨膜区(TM)位于245-261位,C端只有一个氨基酸,可能延伸到核周间隙。在缺失其他病毒蛋白时,其靶向核膜的固有定位基序,其结构与细胞INM蛋白,如Lap2β和Emer-in相似。为研究pUL34中与定位和功能有关的结构域,通过用细胞INM蛋白区域替换pUL34部分区域构建了嵌合蛋白。将C端18个氨基酸,包括TM替换为Lap2β和Emerin的TM和C端结构域,或核纤层蛋白B受体(LBR)的第一个TM,包括其后的9个氨基酸。所有由此产生的嵌合蛋白都弥补了PRV-ΔUL34的复制缺陷,表明TM的替代和C端结构域的扩展都不会干扰pUL34的功能。当C端50个氨基酸用相应的Lap2β序列取代(pUL34-LapCT50),其互补作用降低,但并没有阻断。然而,C端100个氨基酸(pUL34-LapCT100)替换后虽然仍能与pUL31结合,但会产生一个无功能的蛋白,说明这个区域在蛋白功能中起着重要的作用。N端100个氨基酸(pUL34-LapNT100)的替换对核膜定位没有影响,但能阻断pUL31的结合和功能。     

伪狂犬病病毒潜伏感染的研究

论述了近折来在伪犬病病毒潜伏感染方面研究的主要进展，其中包括三个部分，即伪狂犬病病毒感染的分子机理，伪狂犬病病毒潜优感染的诊及伪狂犬病病毒基因工程缺失疫苗的潜伏感染。     

新城疫病毒M蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股负链不分节段的RNA病毒,其基因组大小约为15.2 kb,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白.由于NDV基因组较小,不能编码病毒复制需要的所有蛋白,因此必须借助宿主蛋白来完成NDV的生活周期.M蛋白是一种非糖基化膜相关蛋白,在抑制宿主细胞基因转录、...     

Molecular characterization of duck enteritis virus CHv strain UL49.5 protein and its colocalization with glycoprotein M

The UL49.5 gene of most herpesviruses is conserved and encodes glycoprotein N. However, the UL49.5 protein of duck enteritis virus (DEV) (pUL49.5) has not been reported. In the current study, the DEV pUL49.5 gene was first subjected to molecular characterization. To verify the predicted intracellular localization of gene expression, the recombinant plasmid pEGFP-C1/pUL49.5 was constructed and used to transfect duck embryo fibroblasts. Next, the recombinant plasmid pDsRed1-N1/glycoprotein M (gM) was produced and used for co-transfection with the pEGFP-C1/pUL49.5 plasmid to determine whether DEV pUL49.5 and gM (a conserved protein in herpesviruses) colocalize. DEV pUL49.5 was thought to be an envelope glycoprotein with a signal peptide and two transmembrane domains. This protein was also predicted to localize in the cytoplasm and endoplasmic reticulum with a probability of 66.7%. Images taken by a fluorescence microscope at different time points revealed that the DEV pUL49.5 and gM proteins were both expressed in the cytoplasm. Overlap of the two different fluorescence signals appeared 12 h after transfection and continued to persist until the end of the experiment. These data indicate a possible interaction between DEV pUL49.5 and gM.     

辣蓼黄酮正丁醇部位对PRV感染3D4/2细胞氧化应激相关因子水平的影响

【目的】探究辣蓼黄酮正丁醇部位(N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids, FNB)对猪伪狂犬病毒(Pseudoabies virus, PRV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)氧化应激相关因子的影响,旨在初步分析FNB的抗氧化效果。【方法】采用10^-1至10^-10浓度PRV体外感染猪肾细胞(PK15细胞),计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID₅₀);将3D4/2细胞分为BC组、DMSO组、PRV组、FNB 1、FNB2和FNB3组,BC组用DMEM培养液处理,其余各组用感染复数(multiplicity of infection, MOI)=0.1 RPV处理,孵育2 h后,PRV组添加DMEM培养液,DMSO组及FNB1、FNB2、FNB3组分别添加0.05%DMSO及12.5、25、50μg/mL FNB的DMEM培养液。培养4、8、12、24 h后,分别收取各组细胞培养液上清和细胞,通过试剂盒测定细胞培养液上清中一氧化氮(NO)的含量、细...     

负载口蹄疫病毒VPl-VP4融合蛋白质的树突状细胞对T细胞的活化效应

为研究负载口蹄疫病毒VPl－VP4融合蛋白质的树突状细胞对淋巴结T细胞的活化效应,通过构建pET32a-VPl－VP4原核表达系统制备VPl－VP4融合蛋白。将纯化VPl－VP4融合蛋白负载骨髓源树突状细胞（BMDC）后与淋巴结T细胞共培养,用ELISA检测不同时间点的共培养上清液中IFN－γ的含量。结果表明,负载FMDVVPl－VP4融合蛋白后的BMDC可通过溶酶体－MHC－Ⅱ类分子途径有效地激活淋巴结T细胞,从而启动Thl细胞免疫应答,分泌大量IFN－γ。