马立克病病毒miR-M4-5p宿主靶基因cDNA文库的构建及鉴定

马立克病病毒(MDV)是少数感染自然宿主后可诱发淋巴瘤的疱疹病毒之一,是研究肿瘤发生及发展的理想动物模型。目前已报道MDV可编码数十种miRNA,其中MDV-1编码的miR-M4-5p被鉴定为宿主细胞miR-155的同源物,由于miR-155与人类多种肿瘤性疾病密切相关,这意味着miR-M4-5p可能在MDV的致瘤过程中扮演重要角色。本研究旨在构建miR-M4-5p的宿主靶基因文库并进行初步鉴定。提取鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA,反转录合成cDNA,用hybrid-PCR扩增候选靶基因片段连接到pMD19-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞后挑选单克隆进行PCR鉴定及测序,通过BLAST比对分析,共获得88个宿主候选靶基因序列。优先选择miRNA结合靶点位于mRNA 3′-UTR且与miR-M4-5p种子序列(2~7nt)完全互补配对的29个候选靶基因,构建报告基因载体进行双荧光素酶报告试验,通过三轮双荧光素酶报告试验最终初步鉴定5个宿主靶基因:PRICKLE1、COLA、BCAT1、ANTXR1和TECPR1,为进一步揭示miR-M4-5p的分子调控机制奠定了重要基础。     

马立克病病毒编码的miR-M11-5p宿主靶基因的筛选与鉴定

作为α疱疹病毒的重要成员,马立克病病毒(MDV)感染鸡可引起免疫抑制及快速发作的T细胞淋巴瘤,即马立克病(MD)。此前发现MDV基因组编码大量病毒miRNA,可能在病毒复制、潜伏感染及肿瘤发生中起重要作用。基因敲除miR-M11-5p可显著增强MDV致病性及致瘤性,表明其可能是MD肿瘤抑制因子。为进一步揭示miR-M11-5p介导的调控机制,本研究利用鸡胚成纤维细胞(CEF)总RNA的cDNA为模板,通过hybrid-PCR扩增miR-M11-5p的候选宿主靶基因片段,然后连接至pMD19-T载体、转化至E.coli JM109中构建cDNA文库。对文库菌落进行PCR鉴定、测序分析以及Blast序列对比,共获得77个候选宿主靶基因,其中37个miRNA结合靶点位于候选靶基因的3′-UTR中。进一步通过双荧光素酶报告试验、miR-M11-5p过表达以及RT-qPCR分析,最终鉴定鸡MAFB、LOC776816和RFX7为miR-M11-5p的宿主靶基因。本研究为进一步阐明miR-M11-5p在MDV肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。     

马立克病病毒编码的miR-M4-5p调控宿主靶基因的筛选及鉴定

血清1型马立克病病毒（MDV-1）感染引起的鸡马立克病（MD）一直以来被认为是研究病毒诱导肿瘤发生机制的理想模型。此前研究发现，MDV-1编码的miR-M4-5p是宿主癌基因miR-155的病毒同源物，从基因组中敲除miR-M4-5p可显著降低MDV-1的致病性和致瘤性，表明miR-M4-5p可能是MDV-1诱导肿瘤发生的重要调控因子。为进一步揭示miR-M4-5p的调控机制，以CEF细胞总RNA反转录产物cDNA为模板，利用hybrid-PCR技术构建了miR-M4-5p的候选靶基因文库。通过基因克隆、PCR鉴定及序列比对分析，获得128个候选基因序列，有73个基因的3'-UTR存在miR-M4-5p的潜在结合靶点，其中23个3'-UTR结合靶点与miR-M4-5p完全互补配对。通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR分析，对miR-M4-5p与3'-UTR的体内外相互作用以及候选靶基因的表达水平进行分析和验证，最终鉴定DPT、TMEM230和DCLK1为miR-M4-5p调控的宿主靶基因。本研究为后续进一步阐明miR-M4-5p在MD肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。     

马立克病病毒编码的miR-M4-5p调控宿主靶基因的筛选及鉴定

血清1型马立克病病毒(MDV-1)感染引起的鸡马立克病(MD)一直以来被认为是研究病毒诱导肿瘤发生机制的理想模型。此前研究发现,MDV-1编码的miR-M4-5p是宿主癌基因miR-155的病毒同源物,从基因组中敲除miR-M4-5p可显著降低MDV-1的致病性和致瘤性,表明miR-M4-5p可能是MDV-1诱导肿瘤发生的重要调控因子。为进一步揭示miR-M4-5p的调控机制,以CEF细胞总RNA反转录产物cDNA为模板,利用hybrid-PCR技术构建了miR-M4-5p的候选靶基因文库。通过基因克隆、PCR鉴定及序列比对分析,获得128个候选基因序列,有73个基因的3′-UTR存在miR-M4-5p的潜在结合靶点,其中23个3′-UTR结合靶点与miR-M4-5p完全互补配对。通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR分析,对miR-M4-5p与3′-UTR的体内外相互作用以及候选靶基因的表达水平进行分析和验证,最终鉴定DPT、TMEM230和DCLK1为miR-M4-5p调控的宿主靶基因。本研究为后续进一步阐明miR-M4-5p在MD肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础。     

MDV-1编码miRNA的研究进展

miRNA是具有19～25nt长度的内源性非编码RNA,它通过与mRNA的3'非转录区域(3'-UTR)结合而影响蛋白质的合成,从而达到调控基因的作用。马立克氏病病毒(MDV)是一种可以导致禽类产生肿瘤性疾病的疱疹病毒,而miRNA作为基因转录后调控因子可以影响肿瘤形成过程。文章从MDV-1编码miRNA所处的位置,它们所作用的靶基因及监测它们在感染MDV的组织和细胞中的表达水平三方面阐明了miRNA与MDV-1的致瘤性有着重要的关系。     

gga-miR-140-3p抑制马立克病病毒转化细胞MSB1增殖、迁移和侵袭

以马立克病病毒(MDV)感染SPF白来航鸡,收集脾和肝来源的淋巴瘤,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)进行检测,结果显示gga-miR-140-3p在感染MDV的肿瘤化脾和肝淋巴瘤中低表达。为揭示该miRNA在马立克病(MD)肿瘤转化过程中的作用,以该miRNA为研究对象,MDV转化细胞系MDCC-MSB1为试验材料,分别转染miRNA激动剂或阴性对照,检测细胞增殖和迁移,并检测与细胞侵袭密切相关的基因MMP2和MMP9mRNA表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,转染gga-miR-140-3p激动剂后,细胞增殖在24、36和48h后发生显著(P0.05)抑制,在60和72h后发生极显著(P0.01)抑制。转染激动剂后,细胞迁移数也显著(P0.05)减少。转染激动剂后,MMP2在转染后24h转录显著下调(P0.05),转染后48和72h转录极显著(P0.01)下调,MMP9基因在转染后48h转录显著(P0.05)下调。gga-miR-140-3p作为在MDV感染组织中异常表达的miRNA,能够影响MD肿瘤淋巴细胞的特征——增殖、迁移和侵袭,提示该miRNA可能参与MD肿瘤转化过程。     

miRNA干扰gM基因对马立克氏病病毒体外复制的抑制作用

用miRNA Target Finder分析软件预测干扰RB1B株马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus，MDV）gM基因翻译的潜在靶序列，从中筛选出3个作为干扰对象，根据干扰载体pRFPRNAiC特点，设计合成3对单链DNA序列，经PCR反应扩增出双链DNA，并将其插入干扰载体pRFPRNAiC，构建重组干扰质粒pRFPRNAiCgM1、pRFPRNAiCgM2、pRFPRNAiCgM3。将质粒pRFPRNAiCgM1以不同的剂量转染鸡胚成纤维（CEF）细胞，确定最佳转染质粒量，试验结果表明1μg转染剂量转染效果最佳。以1μg剂量将3种重组干扰质粒分别转染CEF细胞，24h后感染RB1B株MDV，72h后用空斑计数MDV在CEF细胞上增殖数量，以此判定miRNA干扰效果，结果显示，重组干扰质粒中质粒pRFPRNAiCgM2干扰效果较好，能有效抑制MDV在CEF上的生长繁殖。     

鸡对马立克氏病病毒免疫应答的录组和蛋白质组研究

近年来兴起的病毒基因组或部分目的基因以及蛋白表达分析技术,为人们更好地认识宿主对马立克氏病病毒(MDV)的免疫应答机制提供了有利帮助.本文主要综述了从转录组学和蛋白质组学开展的有关MDV致病机理、宿主对MDV反应、MD遗传抗性或易感性以及疫苗诱导的免疫反应等方面的最新研究进展,并讨论了应用miRNA以及RNAi技术对基因、蛋白和信号通路在MDV与宿主相互作用中发挥重要作用的效应单位进行功能分析.     

马立克病病毒超强毒株GX0101感染宿主部分病毒基因表达水平及致病阶段分析

旨在探讨马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101对宿主的感染过程及致病阶段,即"Cornell模型",为进一步使用该毒株研究MDV的致病或致瘤机制奠定基础。用GX0101接种1日龄SPF鸡,建立了感染宿主的动物模型;然后用RT-qPCR分析10个具有代表性的MDV蛋白编码基因在感染不同时间点的动态基因转录水平。结果显示,GX0101感染发病鸡的临床症状及剖检病变与典型的马立克病一致;MDV编码的结构蛋白基因gB、gE和UL6、非结构蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、水平传播相关基因UL13以及磷酸化蛋白基因pp38具有相似的转录水平和趋势,均在GX0101感染后7d上升至第一个峰值,10d降至低谷,14d又逐渐升高并在21d达到第二个峰值,30~60d逐渐下降并处于较低的转录水平;MDV编码的原癌基因meq和毒力相关基因RLORF6在GX0101感染7d即持续升高,并在14~60d的试验周期内较长时间处于高转录水平。结合作者此前研究及本文结果分析,GX0101感染宿主的"Cornell模型":早期增殖性-限制性感染期为1~7d,潜伏感染期约为10d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制期发生于14~21d,而T细胞转化及淋巴瘤形成阶段可能在14d前后就已经开始。     

马立克氏病病毒可关闭宿主抗肿瘤调控基因表达

英国爱丁堡大学的科学家针对马立克氏病病毒(MDV)的基因表达,研究了鸡的抗性和敏感品系针对MDV的宿主反应,2个品系间的内在差异表达以及宿主感染后病毒基因表达变化。研究人员在MDV感染4d后发现了一个新的发病机制,包括HIC1在内的转录因子结合位点出现基因表达下调。     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

感染马传染性贫血病毒的巨噬细胞差异表达microRNA分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)感染靶细胞-马单核巨噬细胞(eMDM)后细胞内microRNA (miRNA)表达的变化,本研究采用EIAV强毒株EIAVDLV34感染eMDM,并以未感染组作为对照,提取细胞内总RNA,通过高通量测序分析细胞内miRNA表达谱的变化。结果显示,与对照相比,感染EIAVDLV34后eMDM有16个miRNA发生差异表达,其中8个miRNA上调表达,8个miRNA下调表达,通过荧光定量PCR技术对这16个miRNA的表达进行了验证,结果与高通量测序一致,最后利用生物信息学方法对这16个miRNA的靶基因及其参与的生物学过程进行了分析,显示靶基因主要参与转录调控、信号转导、细胞凋亡等生物学过程。本研究为进一步分析EIAV与其宿主相互作用、致病机制以及慢病毒相关疾病的预防提供了参考依据。     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。     

中药黄芩苷体外抗马立克氏病病毒作用的研究

探讨黄芩苷体外抗马立克氏病病毒(MDV)作用,应用细胞病变观察法(CPE)观察MDV对鸡胚成纤维细胞(CEF)的影响,采用Reed-Muench法计算MDV细胞半数感染量(TCID50),以CEF为宿主细胞,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法从黄芩苷对MDV的增殖抑制、感染阻断以及直接灭活3个给药途径探讨黄芩苷抗MDV作用。结果显示:MDV对CEF的TCID50为10-4.5/0.1 m L;3种给药途径下,黄芩苷浓度在312.5~78.13μg/m L范围都具有较好的抗MDV感染作用,并且感染阻断途径下黄芩苷浓度为312.5~156.25μg/m L时能够促进细胞的生长,直接灭活途径下黄芩苷浓度为312.5μg/m L时能够促进细胞的生长。其中感染阻断与直接灭活途径给药比增值抑制途径给药的抗MDV感染作用效果要好,直接杀灭途径给药时的病毒抑制率最高。     

捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株与耐药虫株差异miRNA的转录组学分析

为探究捻转血矛线虫的伊维菌素(IVM)敏感虫株与耐药虫株显著差异的microRNA (miRNA)转录谱，发掘其耐药相关的miRNA，本实验采用Illumina Hiseq2000平台分别对捻转血矛线虫IVM敏感虫株与耐药虫株测序，构建cDNA文库，通过质控后采用生物信息学软件筛选捻转血矛线虫IVM敏感与耐药虫株的差异mi RNA。结果显示，捻转血矛线虫的IVM敏感与耐药虫株筛选出转录显著差异的miRNA共375个，其中253个转录上调，122个转录下调。利用RNAhybrid (V6.01)、Miranda (V3.3a)、TargetScan (V7.0)软件对筛选到的mi RNA靶基因进行预测，并取交集作为mi RNA靶基因预测结果，将筛选出显著差异的靶基因通过perl脚本与显著差异的miRNA进行关联分析，结果显示共关联到2 106对miRNA-mRNA为负调控关系，其中涉及到477个差异的m RNA和603个差异的miRNA。对显著差异的miRNA靶基因进行GO富集分析，结果显示其中有492个GO terms，包括生物过程(BP) 322个、细胞组分(CC) 47个、分子功能...     

马立克氏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以马立克氏病毒814株(MDV-814)作为免疫用抗原,建立了2个MDV特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株—4A6、3D7。鉴定结果表明;两株细胞所分泌的McAb均为IgM类免疫球蛋白,具有MDVⅠ型病毒特异性,无中和反应特性和沉淀反应特性。利用两种McAb对国内标准强毒MDV-京1株进行鉴定,肯定其为MDV-Ⅰ型毒株。     

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。     

乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库构建及miR-1-3p靶基因预测

本试验旨在构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊不同发育时期的小RNA文库和预测筛选miRNA的候选靶基因。通过高通量测序技术构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库|采用荧光定量PCR对高通量测序结果进行验证|利用miRDeep2软件对miRNA（长度为20~24 nt的小RNA）进行鉴定|利用Targetscan v7.0、RNA22 v2.0和MiRanda三个在线靶基因预测软件对miR-1-3p的靶基因进行预测分析。成功获得乾华肉用美利奴羊次级毛囊生长期、退行期、休止期小RNA纯净reads分别为10279515、11712215和10926258。分别基于荧光定量与高通量测序的5个miRNA的相对表达量结果趋势基本一致。从次级毛囊生长期、退行期和休止期分别鉴定获得miRNA 1250、1304个和1266个。确定成纤维细胞生长因子14（FGF14）和类胰岛素生长因子Ⅰ 受体（IGF1R）为miR-1-3p的候选靶基因。研究结果为后续靶基因验证及确定调控乾华肉用美利奴羊毛囊周期性发育的候选基因奠定基础。 [关键词] 乾华肉用美利奴羊|小RNA文库|miR-1-3p|靶基因预测     

表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90蛋白的重组马立克氏病病毒的构建及生物学特性分析

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90。通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株。将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性。结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异。PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在。IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白。体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义。     

新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制.本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析.结果 显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺上调基因有111个,下调基因有78个;感染组肝中上调基...