基于PEDV N蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻(procine epidemic diarrhea,PED)快速病原学诊断方法,试验用纯化的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合筛选阳性杂交瘤细胞,并进行间接免疫荧光试验。在此基础上,以单克隆抗体(MAb)为包被抗体,PEDV阳性猪源多克隆抗体(PcAb)为检测抗体建立检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法,并检测了该方法的特异性、灵敏度、重复性,以及与RT-PCR方法的符合率。结果表明:试验成功筛选到一株能够稳定分泌抗PEDV的MAb 13C3A10-2;通过间接免疫荧光试验鉴定,该MAb为PEDV型特异性MAb;建立的DAS-ELISA方法针对猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒的检测结果均为阴性;对PEDV CV777细胞毒的最低检出量为5×10~3 TCID_(50)/mL;具有良好的重复性,组内变异系数为4.57%～7.81%,组间变异系数为4.78%～7.36%;DAS-ELISA与RT-PCR比较,阳性符合率为94.7%。说明试验建立的PEDV DAS-ELISA方法可以初步用于PED病原学诊断。     

旋毛虫53kuES重组蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制

为建立一种简易、快速检测动物血清中的旋毛虫排泄分泌(Excretory-secretory,ES)抗原的胶体金免疫层析试纸法,本研究选用旋毛虫53 ku ES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体(MAb).利用辛酸-饱和硫酸铵法和亲和层析柱联合法纯化MAb及兔抗旋毛虫53 ku ES多克隆抗体,利用枸橼酸三钠还原法制备的胶体金颗粒标记MAb,制备免疫金标试纸条.结果表明,获得的2株IgG1型杂交瘤细胞系4D10和5A2能够稳定分泌抗体,且效价高;胶体金标记MAb 4D10所制备的试纸条具有重复性好、灵敏性和特异性高的优点;该试纸条4℃条件下可密封保存6个月以上.     

猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光.     

猪流行性腹泻病毒时间分辨荧光免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)时间分辨荧光免疫层析检测方法(TRFIA),本研究采用杂交瘤技术制备了抗PEDV N蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5E6和1B7,将MAb 5E6与荧光微球偶联包被结合垫,将MAb 1B7和兔抗鼠IgG抗体分别包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线制备PEDV荧光微球免疫...     

快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段.     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白，参与病毒的早期感染，具有较强的免疫原性，常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb)，本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54)，采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示，rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带，经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠，三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫，3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示，三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000，表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示，获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性，采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示，3株MAb均在...     

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP (rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105.间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgGl/κ.特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应.免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原.该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件.     

犬细小病毒单克隆抗体的制备及其在胶体金免疫层析试纸研发中的应用

为制备犬细小病毒胶体金免疫层析试纸,将F81细胞中分离的CPV免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,建立间接ELISA方法筛选分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,获得1株能稳定分泌CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E2。3E2的亚类为IgG1型,腹水抗体效价为1.8×105,交叉试验表明,3E2可与CPV特异性结合,与其他犬常见病毒无交叉反应。用3E2单克隆抗体制备的检测CPV的胶体金免疫层析试纸条特异性良好,为诊断和研究CPV奠定了基础。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性分泌性Ig A (PEDV SIg A)抗体,本研究以纯化的PEDV粒子作为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子处理样品为检测样品,以HRP标记的鼠抗猪SIg A分泌成分(SC)的单克隆抗体(MAb)为酶标二抗,经过各条件优化,建立了检测初乳和直肠黏膜中PEDV SIg A的间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,PEDV粒子的最佳包被浓度为5.8 ng/孔,HRP标记的鼠抗猪SC抗体的最佳稀释度为1∶3 000。该方法与TGEV、Po RV感染的初乳样品无交叉反应,特异性较强。当初乳的稀释度在1∶6 400时,该ELISA方法检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIg A水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,具有很好的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术的建立和初步应用

用胶体金标记纯化后的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因工程表达抗原,建立一种以微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法(GICA).特异性交叉试验证明GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性.与其他方法对比检测证实了其敏感性.生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性.猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体提供了一种快速简便的方法.     

猪初乳中PEDV IgA抗体捕获ELISA检测方法的建立及其初步应用

为建立评价猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗免疫效力的方法，本研究利用纯化的PEDV免疫BALB/c小鼠，按照常规方法制备PEDV全病毒单克隆抗体(MAb)作为捕获抗体，PEDV细胞培养上清为夹心抗原，HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，采用棋盘滴定法对各反应条件优化后建立了用于猪初乳中PEDV IgA检测的捕获ELISA方法，并确定其临界值为0.25。采用该捕获ELISA对PEDV、PCV2b、PRRSV、PRV、JEV、PPV、FMDV与CSFV IgA抗体阳性猪初乳进行检测，结果显示，除PEDV IgA抗体阳性猪初乳检测结果为阳性外，其他病毒抗体阳性猪初乳检测结果均为阴性，表明该方法特异性强。采用该方法和BIONOTE PEDV IgA试剂盒对从1∶10开始2倍倍比稀释的16个稀释度的阳性猪初乳样品检测，结果显示该方法对阳性样品检测的最大稀释度为1∶40 960，是BIONOTE PEDV IgA试剂盒敏感性的16倍(1∶2 560)，表明本研究建立方法的敏感性高。分别采用同一批次和不同批次制备的MAb包被的ELISA板分别检测5份PEDV IgA抗体阳性和1份PEDV IgA抗体阴性...     

检测犬抗狂犬病毒抗体的胶体金免疫层析法的建立及应用

为建立一种简便快速的胶体金免疫层析方法(GICA)以用于检测犬抗狂犬病毒抗体,本研究运用间接反应一步法原理,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒用以标记抗犬IgG抗体形成金-抗犬IgG抗体复合物,制成金标结合垫,加上包被有狂犬病毒糖蛋白的硝酸纤维膜,即制成胶体金免疫层析试纸条.样品中狂犬病?　 毒抗体与金标记抗体结合后沿硝酸纤维素膜移动,与膜上的糖蛋白特异结合形成肉眼可见的红色线条.试验结果显示,GICA试纸条与抗狂犬病毒抗体有特异性反应,与犬瘟热病毒、犬细小病毒等的抗体无交叉反应;GICA与标准ELISA法比较的总符合率为99.4%.结果表明,GICA试纸条检测抗狂犬病毒抗体特异性强、成本低,操作简便,不需任何仪器,特别适用于野外以及现场使用.     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

分泌抗猪流行性腹泻病毒中国变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

以纯化的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中国变异株(CH/ZMDZY/11)S蛋白N端高变区(22-380aa)重组蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,以纯化CH/ZMDZY/11全病毒及带His标签的重组蛋白分别为筛选抗原,利用淋巴瘤杂交技术获得了一株稳定分泌抗S蛋白特异性单克隆抗体细胞株,命名为2D1。该株杂交瘤细胞诱生小鼠产生的腹水抗体效价为1∶3 200,免疫球蛋白类型为IgM。ELISA检测该单抗与PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒的反应显著差异,可区分流行毒株和疫苗毒株;但该单抗用于Western blot不能区分PEDV流行株和疫苗株。ELISA及Western blot试验结果显示,该单抗有较好的PEDV特异性,可用于检测PEDV。     

猫杯状病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白VP1的单克隆抗体(MAb)及鉴定其表位,本研究以原核表达的重组VP1-E蛋白(aa427~aa524)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合制备杂交瘤细胞;以纯化的FCV-2280病毒粒子作为检测抗原,采用间接ELISA检测方法筛选杂交瘤细胞株,分析杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型、中和活性及所识别的抗原表位等。结果表明,获得两株稳定分泌抗FCV VP1-E MAbs的杂交瘤细胞E2F1和E2F6,抗体均为IgG1亚型,轻链为κ链。杂交瘤细胞分泌的抗体无中和活性。Western blot结果显示,两种抗体可以特异性识别FCV-2280,表明其针对的抗原表位为线性表位。两株MAb识别VP1-E序列均为~(467)YICGSLQRAWG~(477)。生物信息学分析显示该抗原表位在FCV VP1蛋白中相对保守。该MAb为建立特异性强、灵敏度高的FCV的检测方法奠定基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒（DTMUV）的方法,以2株（B9D7B8G10和B9D10C7株）抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜（NC膜）检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示：制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了...     

马传染性贫血病毒p26蛋白单克隆抗体的制备

为制备马传染性贫血病毒(EIAV)的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的EIAV p26蛋白作为免疫原免疫8周龄的BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,建立抗EIAV衣壳蛋白p26抗体的杂交瘤细胞.应用重组p26蛋白为抗原建立ELISA筛选方法,获得两株能够稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为E11和F8.经试验证明,这些抗p26MAb均能够与感染驴胎皮肤细胞的EIAV和经SDS-PAGE分离的EIAV总蛋白中的p26蛋白结合.这两株p26蛋白MAb的获得将为EIAV的检测及鉴别诊断奠定基础.     

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立便捷、快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的免疫层析方法,本研究利用G蛋白标记胶体金制备金标垫,以PCV2病毒样颗粒(VLPs)和兔Ig G分别作为检测线与质控线组装胶体金试纸条。检测结果显示,该试纸条与A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等猪其它病毒抗体阳性血清无交叉反应,仅对PCV2抗体阳性血清具有高度的特异性;对PCV 2阳性血清最低检测限为1∶6 400稀释度,敏感性较高;批内、批间变异系数CV均小于5%,重复性较好。试纸条在4℃保存6个月,其特异性和敏感性无明显变化。对采集的100份临床血清样品进行检测,该方法与标准ELISA的总符合率为98%。表明本研究建立的PCV2抗体的胶体金免疫层析检测方法具有敏感、特异、稳定等特点,可以做为评价PCV2疫苗免疫效果及其感染筛查的检测方法。     

A型流感病毒NP蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL～101.57 ng/mL时与OD_(450nm)呈良好的线性关系,相关系数R~20.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。