锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆表达与免疫原性分析

为了克隆表达锡兰钩虫谷胱甘肽-S-转移酶(Ace-GST)基因,制备多克隆抗体并分析其免疫原性,为疫苗候选分子的筛选奠定基础。根据GenBank上锡兰钩虫GST基因序列设计引物,利用RT-PCR法扩增Ace-GST基因,将扩增产物克隆至pET-32a载体并转入E.coli BL21(DE3)宿主菌表达,重组蛋白纯化后免疫昆明小鼠,分别用间接ELISA法和MTT法检测免疫鼠血清IgG抗体水平与脾淋巴细胞增殖情况。结果显示Ace-GST基因ORF全长468 bp,编码155个氨基酸,与ν类GSTs聚为同一分支;重组Ace-GST相对分子质量为36 000,可诱导产生特异性IgG抗体,并能显著刺激免疫小鼠脾淋巴细胞增殖。结果表明重组Ace-GST蛋白能诱导昆明小鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。     

犬TfR胞外区密码子的优化、真核表达及与犬细小病毒VP2蛋白结合

为制备大量具有天然活性的犬胞外区可溶性转铁蛋白受体(sTfR),本试验通过密码子优化提高sTfR在真核细胞中的表达水平.利用RT-PCR方法从犬肝脏中扩增sTfR编码基因,依据该基因编码的氨基酸序列,参照人偏爱的密码子,对该基因进行密码子优化并由公司合成.利用peDNA3.1-CD5质粒分别构建野生型和密码子优化的sTfR基因真核表达载体,经磷酸钙介导使其在HEK293T细胞中进行表达,利用Western-blotting鉴定表达产物,通过ELISA检测重组犬sTfR蛋白与犬细小病毒VP2蛋白的结合活性.结果显示本试验扩增的犬sTfR基因与GenBank该基因序列的同源性为100%;通过在HEK 293T细胞中进行瞬时表达,结果显示密码子优化可以明显提高sTfR基因在HEK 293T细胞中的表达水平,提高了75%.同时表达的sTfR蛋白能够与犬细小病毒VP2蛋白进行特异结合,表明表达的重组sTfR蛋白具有天然活性.     

锡兰钩虫SLP-1基因的克隆表达与免疫学特性分析

为了研究锡兰钩虫鞘脂激活蛋白样蛋白(Ace-SLP-1)的免疫学特性,本研究以锡兰钩虫成虫cDNA为模板,根据GenBank中Ace-SLP-1基因序列(DQ855414.1)设计特异性引物,采用RT-PCR扩增Ace-SLP-1基因,结果显示,PCR扩增了Ace-SLP-1基因,其ORF全长315bp,编码104个氨...     

藏獒犬IFNγ基因的克隆表达及其生物学活性测定

通过RT-PCR技术从刺激的藏獒犬外周血淋巴细胞中成功克隆IFNγ全基因,其大小为501bp,编码167个氨基酸,前23个AA为信号肽,与GenBank上发表的犬IFNγ((NM001003174.1)比较,序列的同源性为99.4%。构建了原核表达载体pET-30a-IFNγ,转化BL2L,IPTG诱导后表达约23Kd的重组蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化后,纯度达90%以上;利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬γ干扰素的生物学活性,结果显示纯化的蛋白具有一定的抗病毒活性,本研究结果为进一步研究犬γ干扰素的抗病毒活性奠定基础。     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征及其蛋白核酸酶活性分析

为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至原核表达载体p ET32a构建重组表达质粒(pET32a-5'-nucleotidase),转入大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导表达,亲和层析法纯化后采用SDS-PAGE和western blot进行分析。采用酶切活性试验分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示,鼠伤寒沙门菌SL1344株5'-nucleotidase基因为1 482 bp,5'-nucleotidase核苷酸序列与其它22种微生物的5'-nucleotidase及其类似物的同源性较低,最高仅为52.8%。理论上蛋白的分子量为57.18 ku,编码523个氨基酸。SDS-PAGE和western blot结果显示5'-nucleotidase重组蛋白约72 ku,且以可溶性和包涵体两种形式表达。同时,酶切活性试验结果显示重组5'-nucleotidase蛋白具有降解DNA的能力。本实验克隆了鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因,并表达得到了具有核酸酶活性的重组蛋白,为进一步研究5'-nucleotidase基因在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。     

弓形虫棒状蛋白ROP54编码基因的生物信息学分析及原核表达

为了能够获得刚地弓形虫RH株棒状蛋白ROP54的重组蛋白，本研究进行了弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因的生物信息分析及原核表达。运用RT-PCR方法扩增刚地弓形虫RH株ROP54蛋白编码基因序列，并连接至pMD-18-T载体，构建出克隆质粒pMD-ROP54后，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序后对基因序列进行生物信息分析。将pMD-ROP54及pET-28a经双酶切及连接，构建出原核表达质粒pET-ROP54,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况，Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果显示，成功扩增出长度约1 440 bp的ROP54蛋白编码基因序列。生物信息学分析显示，测序结果与刚地弓形虫M49株比对同源性为99%。预测ROP54蛋白氨基酸序列1至26个氨基酸为信号肽，亲/疏水性最小值是-2.978,最大值是2.700。成功构建了原核表达质粒pET-ROP54,IPTG诱导后经，SDS-PAGE结果可见约52.94 kDa大小的蛋白表达，且能够被犬抗弓形虫血清识别，具有良好的反应原性。本研究成功...     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为获得纤维小体(cellulosome)的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列(GenBank登录号:JN109634.1)设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867 bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870 bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037 ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33 ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。     

鸽MX基因的克隆及序列分析

本实验利用干扰素诱导剂Poly(I:C)诱导鸽成纤维细胞,提取细胞总RNA,根据Gen Bank中公布的鸽基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增白卡奴鸽MX基因全长编码区序列。结果表明:白卡奴鸽MX基因编码区长2 106 bp,编码701个氨基酸残基,推测蛋白分子量大小为79.7 ku,等电点为6.37;通过与Gen Bank中已登录的脊椎动物MX基因序列对比,核苷酸序列的同源性为54.0%~78.0%,氨基酸序列的同源性为41.3%~69.3%。本实验成功克隆了白卡奴鸽MX基因,证实其编码的蛋白具有脊椎动物MX基因共有的结构特征,为进一步研究白卡奴鸽MX基因的抗病活性及其作用机制奠定了基础。     

鸭疫里默氏菌甲羟戊酸激酶基因的重组表达与免疫保护效果研究

在从鸭疫里默氏菌(RA)基因组文库筛选毒力基因的过程中,作者获得了编码RA甲羟戊酸激酶的基因(RAMVA),将该基因片段提交GenBank,收录号为GQ398751。测序分析结果显示其开放阅读框长492 bp,共编码163个氨基酸。根据序列信息设计引物,用PCR方法从RA中扩增出RAMVA的编码区并与表达质粒pMAL-C2X连接,构建重组质粒pMAL-RAMVA。经限制性酶切和序列测序鉴定序列正确无误后将pMAL-RAMVA转化至E.coliBL21(DE3)构建重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-RAMVA。用IPTG诱导重组菌成功诱导RAMVA的表达,通过SDS-PAGE分析表达产物,表达量占全菌总蛋白的15.6%,且重组表达的甲羟戊酸激酶在大肠杆菌中表达时以可溶性状态存在。雏鸭免疫试验表明,接种重组表达菌E.coliBL21/pMAL-C2X-RAMVA2周后,可产生对RA致死量攻击达42.3%的免疫保护率。     

猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备

本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

亚洲璃眼蜱差异表达新基因P18的克隆和鉴定

为了进行抗蜱和蜱传病疫苗的研究,本实验对亚洲璃眼蜱雌蜱吸血前后唾液腺消减文库中获取的一个全长编码基因P18进行了研究。该基因全长519bp,共编码170个氨基酸,分子量为18.36Ku,等电点为4.28。BLAST分析表明,该基因预测的氨基酸与肩突硬蜱、篦子硬蜱唾液腺的抗凝血小肽有30%～40%低度同源性。将该基因亚克隆到pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导,重组融合蛋白以可溶性形式高效表达。将可溶性重组蛋白免疫小鼠后获得的抗血清。经免疫印迹分析表明,该重组蛋白抗体可特异性的识别半饱雌蜱唾液腺中的天然蛋白抗原,而未吸血雌蜱唾液腺中则不显现特异条带。RT-PCR结果进一步证实,该基因在蜱吸血后的唾液腺中差异表达。     

柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的克隆、序列分析及重组表达

为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)细胞色素bc 1复合物(cytochrome bc1,Cytbc1)的生化特性,本研究对其基因进行了克隆和原核表达。根据EupathDB已公布的E.tenella Houghton株Cytbc1基因序列(Contig ID:ETH 00007855)设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtCytbc1基因序列,并将其克隆到表达载体pCold43a中,构建重组质粒pCold43a-EtCytbc1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞E.coli Rosetta(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,EtCytbc1的ORF序列(687bp),编码228个氨基酸;重组菌pCold43a-EtCytbc1能成功诱导表达,pCold43a表达部分可溶性蛋白,表达产物纯化后可用于酶生化特性分析。柔嫩艾美耳球虫Cytbc1基因的成功克隆表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

黄色瘤胃球菌纤维小体脚手架蛋白ScaC基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为获得纤维小体（cellulosome）的基本元件,本试验以滩羊瘤胃液微生物混合DNA为模板,根据黄色瘤胃球菌纤维小体的脚手架蛋白ScaC基因序列（GenBank登录号：JN109634.1）设计特异性引物,扩增纤维小体脚手架蛋白基因,并对其进行克隆、测序及核苷酸和氨基酸序列分析;同时构建脚手架蛋白基因原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,试验利用1对引物同时成功克隆获得2个脚手架蛋白编码基因,其中一个基因全长867 bp,编码288个氨基酸,命名为ScaC2基因;另一个基因全长870 bp,编码289个氨基酸,命名为ScaC7基因。核苷酸序列分析表明,脚手架蛋白基因ScaC2与ScaC7的核苷酸序列相似性为74.1%,ScaC2基因与黄色瘤胃球菌AGY80P318及ScaC7基因与黄色瘤胃球菌DA640P037 ScaC基因核苷酸序列相似性均为99%;氨基酸保守序列分析显示,ScaC2和ScaC7氨基酸序列均具有典型的脚手架蛋白结构域,含有1个Ⅰ型黏附域和1个Ⅰ型锚定域。蛋白表达分析显示,ScaC2和ScaC7基因均能在大肠杆菌中实现可溶性表达,表达产物大小约为33 ku。本试验克隆获得的纤维小体的脚手架蛋白基因ScaC2和ScaC7可为后续人工纤维小体的构建提供基本材料。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

巨型艾美球虫配子体gam82基因的克隆表达与免疫原性分析

提取巨型艾美球虫(Eimeria maxima)南通株(NT株)配子体总RNA,应用RT-PCR技术对gam82基因进行克隆,并对其核苷酸及氨基酸进行序列分析.结果表明,克隆的基因全长为1 791个核苷酸,具有一个完整的开放阅读框,编码596个氨基酸,与GenBank中发表的Houghton株gam82基因同源性为100%.根据对推导的氨基酸序列的二级结构和抗原表位分析的结果,筛选免疫原性良好的区域,命名为gam82-Y,进行原核表达.重组菌经过IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,gam82-Y基因片段在大肠杆菌中得到了融合表达,相对分子质量约为53 000.可溶性分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在.以 E.maxima高免血清为一抗进行Western-blot检测,显示重组抗原gam82-Y具有免疫原性.     

犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子的原核表达

为筛选犬新孢子虫保护性抗原,克隆表达犬新孢子虫巨噬细胞转移抑制因子(MIF)并对其免疫原性进行分析。根据GenBank公布的犬新孢子虫MIF(NcMIF)序列,利用分子生物学软件设计2套特异性引物,以NcMIF mRNA反转录产物为模版,采用PCR扩增出NcMIF基因和2种突变基因NcMIFm和NcMIFhis,选用原核表达载体pET26b,分别构建重组质粒pET26b-NcMIF和pET26b-NcMIFm。重组质粒分别转入E.coli BL21(DE3)中进行表达,纯化后的蛋白利用免疫印迹法进行鉴定。结果显示,rNcMIF和rNcMIFm这2种重组蛋白在BL21(DE3)表达菌株中均为可溶性表达,诱导表达最佳条件为30℃诱导3h IPTG诱导浓度为1mmol/L;Western blot分析结果表明,该表达产物能与抗rNcMIF绵羊血清发生反应,说明获得的蛋白具有较好的抗原性和特异性。