江西省猪源粪肠球菌毒力基因及耐药性分析

通过选择性培养基、PCR技术分离鉴定粪肠球菌,采用PCR技术检测agg、clyA、efaA、esp、ace和gelE基因,使用K-B法测定分离株对红霉素、多西环素、环丙沙星和氟苯尼考的敏感性。结果共分离并鉴定出226株粪肠球菌。98.23%的粪肠球菌至少携带1种毒力基因,各基因检出率由高到低依次为efaA、ace、gelE、agg、esp和clyA。有75.22%分离株携带3~5种毒力基因。分离株对红霉素和多西环素耐药率较高,分别为97.35%和92.48%,对环丙沙星和氟苯尼考耐药率相对较低,分别为65.04%和61.95%,但没有统计学上的区别。因此,携带毒力基因数的多少与抗菌药物的耐药性之间不存在统计学上的关联。     

熊源粪肠球菌小鼠感染模型的建立及其毒力基因的检测

建立了熊源粪肠球菌(Enterococcus faecalis)感染BALB/c小鼠模型,并对熊源粪肠球菌的毒力基因进行检测,同时观察死亡小鼠内脏器官的组织病理学变化。结果:熊源粪肠球菌可以引起小鼠内脏组织发生不同程度的炎性细胞浸润,其对小鼠的LD_(50)为2.04×10~7 cfu/只;通过PCR可检测出胶原蛋白黏附素(ace)、心内膜炎抗原(efaA)、EF3314和明胶酶E(gelE)等毒力基因。研究表明,本试验成功建立了粪肠球菌小鼠感染模型,为熊源粪肠球菌的发病机制研究奠定了基础。     

鸡源粪肠球菌对雏鸡致病力试验和毒力基因gelE及efaA的检测

为了解凉山地区鸡源粪肠球菌毒力基因gelE和efaA的基因表达情况,对毒力基因进行检测和致病力试验。通过实验室提供的粪肠球菌10株,进行致病力试验,结果显示,雏鸡死亡率为0～100%,存在较大差异;进行毒力基因gelE(432 bp)、efaA(591 bp)的检测,10株粪肠球菌阳性率均为100%。根据NCBI的基因序列进行粪肠球菌毒力基因gelE、efaA的同源性比对结果均为100%。     

动物源粪肠球菌对7种抗生素耐药表型及耐药基因检测

为查明动物源(牛、羊、猪、鸡)粪肠球菌分离株对7种常见抗生素的耐药情况(包括耐药表型及相关的耐药基因),采用药敏纸片法、浓度稀释法和VITEK-AMS全自动药敏法3种不同的方法,根据CLSI(2007)判定标准,检测40株分离株的耐药表型;采用聚合酶链反应(PCR)方法,检测分离株中β-内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM)、氨基糖苷类抗生素耐药相关基因(aac(6’)/aph2’’,aph(3’)-Ⅲ,ant(6)-I)、四环素耐药相关基因(tetM)、红霉素耐药相关基因(ermB,mefA)和万古霉素耐药相关基因(vanA,vanB,vanC)。结果表明,分离株对庆大霉素、链霉素、四环素、红霉素、青霉素、阿莫西林表型耐药率分别为:60.0%(24/40),57.5%(23/40),52.5%(21/40),67.5%(27/40),60.0%(24/40),55.0%(22/40),本试验中未发现耐万古霉素粪肠球菌。耐药基因aac(6’)/aph2’’,ant(6)-Ⅰ,aph(3’)-Ⅲ,tetM,ermB,TEM的检出率分别为:55%(22/40),55%(22/40),25.0%(10/40),42.5%(17/40),50.0%(20/40),45.0%(18/40);未检测到mefA,vanA,vanB,vanC基因的菌株。动物源性粪肠球菌多重耐药现象严重,携带抗生素相关耐药基因是导致分离株对抗生素产生耐药的主要原因,从耐药表型和基因型的角度均可证实分离株粪肠球菌具有多重耐药性。     

广东省养禽场肠球菌耐药性及毒力因子流行分布特征

旨在调查和分析广东省养禽场肠球菌的亚型屎肠球菌和粪肠球菌耐药性及其毒力因子流行分布特征,为控制禽源肠球菌耐药性传播、保障公共卫生安全提供理论依据。作者于2018年从广东省4个养禽场采集肠道样品493份,进行屎肠球菌和粪肠球菌的分离鉴定;采用琼脂二倍稀释法测定肠球菌的最小抑菌浓度（MIC）;PCR方法检测肠球菌的耐药基因和毒力基因。结果显示：1）共分离到125株肠球菌,其中粪肠球菌84株（鸡源66株,鸭源18株）;屎肠球菌41株,均来自鸡肠道样本。2）菌株对四环素、多西环素、红霉素几乎全部耐药,对氟苯尼考和氯霉素的耐药率高达89.60%和74.40%。屎肠球菌耐药率普遍高于粪肠球菌,而粪肠球菌对环丙沙星和利奈唑胺的耐药率高于屎肠球菌;鸭源粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率（94%）显著高于鸡源粪肠球菌（39.4%）,屎肠球菌对利奈唑胺均敏感。从鸡分离的1株粪肠球菌对万古霉素耐药。3）耐药基因在屎肠球菌中的检出率高于粪肠球菌,鸭源分离株检出率高于鸡源。耐药基因tetL、fexA、ermB最为流行,检出率均高于90%。其次是optrA基因,检出率为73.60%,poxtA和fexB的检出率均低于20%。在3株鸭源粪肠球菌中检测出cfr基因。4）已检测的毒力基因中efaA的携带率最高,为63.04%（58/92）,其他依次为gelE（54.35%,50/92）、ace（47.83%,44/92）、asa1（44.57%,41/92）。对环丙沙星及高浓度氨基糖苷类耐药的菌株及携带cfr基因的菌株,大多携带agg、asal、gelE或ace。本研究显示养殖场禽源肠球菌耐药严重,鸭源肠球菌对利奈唑胺耐药率高,耐药基因和毒力基因流行且多样,且检测出人医临床重要抗生素耐药基因,应加强对养禽场肠球菌耐药性监测。     

一株具有多种毒力基因的粪肠球菌噬菌体的研究分析

以之前分离出的奶牛乳房炎源粪肠球菌SL22为宿主菌,从临床型乳房炎乳样中分离纯化噬菌体,对其进行生物学特性分析、小鼠治疗试验及毒力基因与耐药基因检测。结果分离到1株噬菌体,该噬菌体形成的噬菌斑如针尖状,电镜下发现该噬菌体无尾,头部呈对称多面体,直径约66 nm,将其命名为vB＿Eco T＿PSL22（简称PSL22）;只裂解其宿主菌,核酸类型为dsDNA;最佳感染复数为0.1,裂解量约为52 PFU/cell;在p H4.0～12.0时活性稳定,能耐受60℃左右高温。对小鼠治愈率为33.33%(2/6),含有2个耐药基因（Acc和aac(3)-Ⅳ）和4种毒力基因（gelE、cylA、ace和efaA）。通过本次试验,可为临床型乳房炎奶牛乳房中噬菌体的多样性研究提供参考,也可为研究奶牛乳房中的微生态系统提供依据。     

广东省某屠宰场猪源肠球菌的分离鉴定及耐药性和毒力基因分析

【目的】了解猪源性肠球菌分离株的耐药情况及毒力因子携带情况,为肠球菌的耐药监测提供数据支持并为制定合理的治疗方案提供科学依据。【方法】本研究对广州市某大型屠宰场屠宰环节156份猪小肠样品进行肠球菌的分离培养、革兰染色、PCR鉴定,采用琼脂扩散法对菌株进行14种抗菌药物和2种消毒剂的最小抑菌浓度(MIC)测定,利用PCR技术检测耐药基因、毒力基因和消毒剂抗性基因的携带情况。【结果】本研究分离到84株肠球菌(分离率为53.85%),包括44株粪肠球菌和40株屎肠球菌;分离培养可见菌落边缘光滑整齐、圆形或卵圆形排列、菌落周围培养基呈现黑色的菌落;疑似菌落革兰染色后呈圆形的革兰阳性球菌,单个或成堆排列在一起。对疑似菌落DNA进行PCR扩增,其中粪肠球菌引物扩增出大小约941 bp的条带,16S rRNA引物扩增出大小约1 500 bp的条带。药敏试验结果显示,44株粪肠球菌对克林霉素、多西环素、头孢噻呋、庆大霉素、红霉素、苯扎氯铵和氟苯尼考的耐药率较高,分别为97.7%、90.9%、88.6%、88.6%、81.8%、81.8%和77.3%;40株屎肠球菌对克林霉素、头孢噻呋、多西环素、庆大霉...     

乌鲁木齐市宠物源粪肠球菌和屎肠球菌耐药性及耐药基因检测

为了解乌鲁木齐市宠物源粪肠球菌和屎肠球菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其耐药基因携带情况,在乌鲁木齐市多家宠物医院、警犬基地、犬养殖基地采集宠物(犬和猫)直肠粪样449份进行粪肠球菌和屎肠球菌的分离鉴定,通过琼脂稀释法测定10种抗菌药物的最小抑菌浓度,利用PCR方法检测11种耐药基因.结果分离鉴定出宠物源粪肠球菌和屎肠球...     

感染仔猪粪肠球菌不同分离株的鉴定及毒力基因检测

从近年来河南省各地感染发病猪群的肠球菌分离株中,选取来源不同且具有代表性的5株分离菌进行了包括致病性和毒力基因测定在内的系统鉴定。结果表明,引起本次河南省仔猪感染发病的病原体为粪肠球菌。各地分离菌的形态、培养特性与以及对极端环境的耐受性上表现较为一致,而对各种糖的发酵上存在着的差异;对药物万古霉素、替考拉宁、利福平和氨苄西林敏感,而对临床常用药物红霉素、卡那霉素和四环素完全耐药;经16S rRNA测定,它们与粪肠球菌ATCC29212同源性在99.6%～99.8%之间,与GenBank公布的NC_004668、AJ301831的核苷酸同源性为99.7%～99.9%和99.5%～99.7%;通过对它们2种毒力表型和携带的6种主要毒力基因以及与对小鼠的LD50测定,发现5株粪肠球菌携带毒力基因不尽相同,携带全部6种毒力基因的HE1和HE5的致病力最强,而仅携带4种毒力基因的HE41致病力最小。用HE1和HE5分离菌对20日龄的断奶仔猪分别进行攻毒,2菌株均能引起仔猪的感染发病。     

牛源肠球菌的分离鉴定及毒力因子基因的检测

为探究牛源性肠球菌中6种毒力因子基因(ccf、asa1、ace、esp、cylA、gelE)的分布情况,采集了不同地区382份疑似隐形乳腺炎的奶样,常规分离纯化细菌,采用16SrRNA和16S~23SrRNA方法相结合的方法,共鉴定出了68株肠球菌并检测了其溶血特性和上述6种毒力基因的存在情况。结果显示,40株(58.82%)表现为α-溶血,10株(14.71%)为β-溶血,18株(26.47%)为γ-不溶血。68株(100%)携带asa1基因,49株(72.06%)携带gelE基因,43株(63.24%)携带ccf基因,12株(17.65%)携带ace基因,10株(14.71%)携带esp基因,6株(8.82%)携带cylA基因。54.41%的分离菌株同时携带gelE、ccf、asa1毒力基因,而青海民和分离株的esp与ace,gelE与ccf同时出现,有一定规律性;但溶血性基因cylA与14株溶血性肠球菌没有相关性。研究牛源肠球菌的溶血特性与毒力基因携带情况,对肠球菌性奶牛乳腺炎的防控具有指导意义,同时也为动物与人之间病原互相传播的研究提供试验依据。     

湖南猪源粪肠球菌的分离鉴定及16S rDNA系统进化分析

从湖南各地送检至实验室的临床样本中分离到42株革兰氏染色阳性及过氧化氢酶阴性的球菌,其中78.6%来自于肺脏,菌落形态及染色镜检均与粪肠球菌参考株ATCC 29212相似,兰氏分群鉴定97.6%（41/42）为D群,生化特性符合粪肠球菌特征。16SrDNA测序鉴定显示：42个分离株与同步测序的ATCC 29212同源性在99.2%到100%之间,与所选择粪肠球菌参考序列的同源性在98.7%到100%之间,NCBI在线BLAST分析发现42株均与GeneBank收录的粪肠球菌序列同源性最高。湖南分离株16SrDNA序列与E.faecalis参考序列进化关系与地域分布无关,来源于不同宿主的菌株的16SrDNA变异并不大,而与E.faecium、E.canis、E.avium、E.hirae等4种肠球菌则有多处变异,这些变异区域在这4种肠球菌中却是保守的。     

致羔羊脑炎粪肠球菌生物被膜形成能力及相关基因检测研究

为观察致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05株生物被膜（BF）的形成能力并检测致羔羊脑炎粪肠球菌BF形成相关基因的携带情况,本研究以XJ05为研究对象,运用96孔板建立不同时间BF模型,染色后酶标仪测定D_{595 nm}值,并用倒置显微镜观察BF形态。同时检测11株菌中与BF形成相关基因（gelE、esp、ace、asa1、asa373、efaA、ef0591、ef3314、ahrc、eep）的携带情况,并对相关基因片段做同源性分析。结果显示,在不同时间段XJ05株BF的生成量与空白对照组相比差异显著（P<0.05）,24 h时D_{595 nm}值最高且与其他各个时间段相比均差异显著（P<0.05）。显微镜下观察6 h时BF初具规模,可见散落的网状结构,12~24 h矩阵网格结构明显,24 h时形成高度有序的网格结构,24 h后网状结构逐渐脱落,BF开始降解。11株菌中10种相关基因的携带情况不同,有6株携带8种基因,1株携带7种基因,1株携带6种基因,1株携带2种基因,有2株未检测到10种基因的任何一种。检出的基因片段同源性均在93.3%~100.0%之间。结果表明,XJ05株能形成完整的BF,11株分离的致羔羊脑炎粪肠球菌中有9株携带部分与BF形成相关的基因。     

Detection on Biofilm and Biofilm-associated Genes of Enterococcus faecalis Inducing Lamb Encephalitis

The purpose of this study was to observe and analyze the ability of biofilm formation of the Enterococcus faecalis (E.faecalis) XJ05 and to detect if the E.faecalis which could induce lamb encephalitis carried the biofilm-associated genes. The E.faecalis XJ05 was used as the sample. The biofilm model was established by the 96-well microtiter plate and read by microplate reader in the D_{595 nm} at the same time observed by the inverted microscope. The primers were designed to examine if the 11 strains of E.faecalis carried the biofilm related genes and then the amplified products were sequenced and analyzed for homology. The results showed that the amount of BF produce in XJ05 strain was significantly different from blank control group at different time (P<0.05), and the highest D_{595 nm} value was at 24 h and significant difference compared with other time (P<0.05). The biofilm of 6 h was scattered when observed under the microscope and the time between 12 to 24 h biofilm to be more denser, after 24 h the biofilm became to degradate and loose gradually. It turned out that the 11 strains of bacteria carried different biofilm-associated genes, 8 biofilm-associated genes were found in 6 strains of bacteria, 7 biofilm-associated genes were find in 1 strain of bacterium, 6 biofilm-associated genes were found in 1 strain of bacterium, 2 biofilm-associated genes were found in 1 strain of bacterium, 2 strains of bacteria could not text out anyone of the detected genes.The homology of all detected genes were all between 93.3% to 100.0%. It concluded that the E.faecalis XJ05 could form the completed biofilm and there were 9 kinds carried the biofilm-associated genes in 11 strains of E.faecalis.     

Enterococcus faecalis of human and poultry origin share virulence genes supporting the zoonotic potential of E. faecalis

Enterococcus faecalis is a major cause of nosocomial infections in humans and has been linked to severe extra‐intestinal infections in poultry. A zoonotic potential has been suggested and the aim of the present study was to investigate similarities in virulence gene profiles of E. faecalis originating from infections in humans and poultry respectively. A total of 106 isolates of E. faecalis [26 human clinical isolates, 60 poultry clinical isolates (including two small‐colony variants (SCVs) and 20 poultry cloacal isolates] were investigated for presence of seven virulence‐associated genes: ace, asa1, cylA, efaA, EF0591, esp and gelE. For each gene, the PCR‐amplification product was sequenced from one isolate in each group to explore intragenic variations between genes of human and poultry origin. Haemolytic and protease activities were assessed and isolates were assigned a sequence type (ST). Three of the seven genes investigated (ace, efaA and gelE) were present in all isolates. The asa1 was detected in 63/80 and 13/26 isolates of poultry and human origin respectively. For cylA, the numbers were 46/80 and 14/26 respectively. Among poultry isolates, esp and EF0591 were the least frequently observed genes (1/80 and 20/80 respectively); the prevalences among human isolates were 1/26 and 18/26 respectively. A high degree of similarity between genes in human and poultry isolates were confirmed by sequencing of amplification products. None of the cylA‐positive isolates demonstrated haemolytic activity, while the phenotypic expression of gelatinase varied. The ST16 was the only ST shared by human and poultry isolates. The SCV isolates did not show a unique virulence profile or phylogeny. In conclusion, regardless of the distinct phylogenetic background of most E. faecalis isolates of human and poultry origin, we found major similarities in virulence gene profile and gene sequences in isolates from the two sources, supporting the zoonotic risk associated with this organism.     

猪源粪肠球菌的BIOLOG系统鉴定及其生物学特性

利用BIOLOG自动微生物分析系统和传统鉴定方法对1株猪源粪肠球菌进行了鉴定，并对其生物学特性进行了系统研究。结果显示，2种鉴定方法的结果一致，与传统的鉴定方法相比，BIOLOG自动微生物分析系统更快捷、方便、高效，可快速为临床诊断和用药提供依据。生物学试验表明，本株粪肠球菌在液体和固体培养基内均可有效抑制大肠杆菌生长，从而维持肠道平衡；另外，该菌株可使培养液的pH值降低至3．69。上述结果为该菌株的进一步开发利用提供了理论支持。     

某养殖场鸡源粪肠球菌分离鉴定及耐药性研究

本文从辽宁某鸡场100份肉鸡盲肠拭子中分离获得粪肠球菌24株,通过ATB细菌鉴定仪进行鉴定确认为粪肠球菌,并对这24株粪肠球菌进行了14种抗生素的药敏试验。结果显示,粪肠球菌对青霉素、万古霉素、氨苄西林和替拉考宁敏感;对红霉素、氯霉素、环丙沙星、四环素、左氧氟沙星和奎奴普汀/达福普汀耐药,耐药率均达到100.0%,养殖场抗菌药物耐药严重。     

鱼源小肠结肠炎耶尔森菌5种毒力基因的检测和分析

采用煮沸法和细菌基因组DNA试剂盒两种方法制备鱼源小肠结肠炎耶尔森菌DNA模板,运用聚合酶链反应(PCR)方法检测小肠结肠炎耶尔森菌的5种毒力基因(ail、yadA、virF、ystB和HPI-int),并对HPI-int基因进行测序分析.结果表明,小肠结肠炎耶尔森菌ail、virF和HPI-int 3种毒力基因被检测出,而另外两种毒力基因ystB和yadA未被检测到.HPI-int基因长度为722 bp,GenBank序列号为JX041513,与该数据库中的小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛基因的相似性达到99％,由此推断该菌株具有较强的致病性.这为深入研究小肠结肠炎耶尔森菌的毒力和危害积累了科学资料.     

粪肠球菌感染小鼠的脑组织病理学观察及转录组学差异分析

旨在通过构建小鼠感染粪肠球菌后的脑部损伤模型,对不同感染时期脑组织的病理学观察及转录组学差异分析,探索粪肠球菌引起脑组织损伤的机制。本试验选择1株致脑膜炎粪肠球菌,以小鼠为感染动物,感染粪肠球菌后,分别在2、4、6、12、24、36、60和72 h采集小鼠脑组织,观察脑组织的损伤程度,挑选早期、明显期和转归期3个时间点,通过转录组学测序,对差异表达基因进行分析,使用荧光定量PCR对转录组学数据进行验证。结果显示：小鼠感染粪肠球菌12 h后,脑组织开始出现病变,通过病理组织学观察发现小鼠脑组织先后出现了脑膜及脑组织血管充血,血管周围间隙增宽,脑组织因水肿有网格状间隙,微血栓形成及炎性细胞浸润。对转录组学差异基因分析,GO富集结果显示主要富集到对β干扰素的反应、细胞对β干扰素的反应、对其他生物的防御反应、对γ干扰素的反应、对细菌的反应、外在凋亡信号通路、调节外在凋亡信号通路、神经元凋亡过程、内皮细胞迁移等生物进程中。KEGG富集结果显示差异信号通路主要富集在过氧物酶体、NOD样受体信号通路、氧化磷酸化、钙代谢信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径、Wnt信号通路、MAPK信号通路、GnRH分泌、VEGF信号通路、紧密连接等一些与脑组织损伤相关的通路上。粪肠球菌感染小鼠后,影响脑组织过氧物酶体、NOD样受体信号通路、氧化磷酸化、钙代谢信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径等通路改变,这些通路与蛋白磷酸化、炎症的发生及血脑屏障通透性的改变有关,为进一步研究粪肠球菌引起脑组织损伤机制提供研究方向和理论基础。     

4株鸭源肠球菌的鉴定和致病性

对临床分离的4株鸭源肠球菌郑1株、郑2株、郑3株、北京株和1株粪肠球菌参考菌株进行了系统鉴定,并用SDS-PAGE和Western-blot技术对各菌株细胞壁蛋白图谱进行比较分析。结果5个菌株的形态、染色、生理生化特性均与粪肠球菌特性一致;它们均对青霉素、万古霉素和庆大霉素敏感而对四环素耐药;5个菌株人工感染雏鸭及小白鼠均有致病性,但各菌株间致病力存在差异,北京株最强,参考株最弱,其余3株介于北京株和参考株之间;各菌株的细胞壁蛋白经SDS-PAGE在相对分子质量33 370~131 690之间均显示数十条蛋白带,其中郑2株和北京株在相对分子质量66 840处均有1条染色较深的蛋白带,而用Western-blot分析显示抗北京株胞壁蛋白抗体只能检测到北京株相对分子质量为66 840的抗原蛋白。以上结果表明,这5个被检菌株为致病性粪肠球菌,且致病性以北京株最强。     

猪源粪肠球菌的分离、鉴定及应用

通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、16SrDNA序列分析和种特异性片段扩增等方法,从健康猪直肠内容物中分离到3株粪肠球菌,其中菌株NA14对常见病原微生物具有较强的拮抗能力;进一步研究表明该菌株具有较强的耐受人工胃液和耐胆汁的能力,能够耐受60℃、30min;动物试验表明饲料中添加该粪肠球菌能够降低仔猪腹泻,改善仔猪生产性能,增强猪瘟疫苗的免疫效果;因此该菌株作为动物益生菌具有好的应用前景。