蜂胶黄酮对病毒诱导PK-15细胞凋亡的影响

为研究蜂胶黄酮对病毒诱导宿主细胞凋亡的影响,将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)分别一起加至单层PK-15细胞培养体系中,用流式细胞仪检测蜂胶黄酮对TGEV和PPV感染PK-15细胞凋亡率的影响。结果显示,与病毒对照组比较,TGEV和PPV感染PK-15细胞后,蜂胶黄酮可以显著降低PPV感染引起的PK-15细胞凋亡率,而对TGEV感染引起的PK-15细胞凋亡率则没有显著影响。说明蜂胶黄酮可以减轻无囊膜的PPV感染对PK-15细胞引起的凋亡。     

S VA及α-干扰素对P K-15细胞microRNA转录谱影响的分析

为探究猪塞内卡病毒A(SVA)感染、干扰素(IFN-α)处理对猪肾细胞(PK-15)微RNA(microRNA,miRNA)转录谱的影响，本研究分别构建SVA感染的PK-15(PK-15/SVA)、IFN-α处理的PK-15 (PK-15/IFN),SVA感染再经IFN-α处理的PK-15细胞(PK-15/SVA/IFN)，通过荧光定量PCR(qPCR)分别检测各组细胞中SVA VP1及IFN-αm RNA的转录水平。结果显示，与PK-15相比，PK-15/SVA及PK-15/SVA/IFN细胞中SVA VP1基因的转录水平极显著升高(P<0.001),PK-15/SVA/IFN中IFN-α的转录水平显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01)。通过转录组测序技术(RNA-Seq)分析各组细胞mi RNA的转录谱，采用Spss软件统计各组细胞中转录差异miRNA的数量；利用基于负二项分布的DESeq2筛选各组细胞中转录显著差异mi RNA；采用miRanda、PITA和RNAhybrid 3个软件预测各组细胞转录显著差异miRNA的靶基因，通过miREvo和mird...     

复方参术汤通过线粒体通路抑制TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的研究

为探讨中药复方参术汤干预猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)诱导猪小肠黏膜上皮细胞(SIEC)凋亡的机制。本试验用TGEV感染SIEC进行体外试验。试验分为复方参术汤组、对照组、TGEV组、苦参碱组,分别于加药后2,4,8,12,24,48,72h收集样本,应用qRT-PCR检测Bcl-2与Bax mRNA转录水平,Western blot检测Bcl-2、Bax、Bid、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平。结果显示,与TGEV组相比,复方参术汤下调TGEV感染SIEC的Bax、Caspase-9、Caspase-3、Cyt c及Bid蛋白表达;复方参术汤极显著上调Bcl-2mRNA的转录(P<0.01),极显著下调Bax mRNA的转录(P<0.01)。结果表明,复方参术汤能够抑制引起细胞凋亡的线粒体通路,从而预防TGEV引起的SIEC凋亡。     

A型塞内卡病毒感染PK-15细胞环状RNA表达谱分析

【目的】分析A型塞内卡病毒(Seneca virus A,SVA)感染猪肾上皮细胞(PK-15)后环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱的变化,探究circRNAs在SVA感染过程中发挥的潜在调控作用。【方法】本研究基于Illumina HiSeq 2000平台对SVA感染及对照PK-15细胞circRNAs转录组进行测序,并对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能及KEGG通路富集分析,通过实时荧光定量PCR对新发现的circRNAs进行表达水平鉴定。【结果】转录组测序结果显示,SVA感染组、PK-15细胞对照组中共有432种circRNAs被发现。在SVA感染PK-15细胞中,87种circRNAs表达水平相对对照组PK-15细胞显著上调,74种circRNAs表达水平显著下调。对差异表达circRNAs的来源基因进行GO功能注释分析表明,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于核仁、细胞器膜和细胞大分子代谢、发育等生理过程。KEGG通路富集结果显示,SVA感染组差异表达circRNAs来源基因主要富集于胞吞过程、cAMP信号通路、Rap...     

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sg RNA,构建重组载体p UC19-RIG-I-sg RNA1和p UC19-RIG-I-sg RNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子m RNA水平,IPMA方法及Taq Man定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的m RNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。     

miRNA-125b在牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

为研究miRNA-125b在致细胞病变牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染牛肾细胞(MDBK细胞)过程中诱导细胞凋亡的机制,本研究将cpBVDV感染MDBK细胞,并将构建的pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞作为阳性对照.采用荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测细胞中miRNA-125b和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2) mRNA转录水平,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率.检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞中miRNA-125b的转录水平分别为正常细胞对照组的2.01倍和3.85倍,Bcl-2 mRNA的转录水平分别为对照组的0.71倍和0.31倍;pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞48 h后,Bcl-2 mRNA的转录水平为正常细胞对照组的0.42倍.细胞凋亡检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞的凋亡率分别为15.06％和36.43％;pcDNA3.1-miR-125b转染48 h,细胞的凋亡率为25.56％.结果表明miRNA-125b在cpBVDV感染MDBK细胞过程中能够通过抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平从而诱导细胞产生凋亡.     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

肠小体感染猪传染性胃肠炎病毒模型的建立

来源于肠隐窝干细胞的肠小体能模拟体内肠上皮复杂的生理特性,已成为研究宿主与肠道病原相互作用的理想的体外细胞模型。为探究肠小体能否作为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染模型,本研究从仔猪的回肠组织分离培养隐窝干细胞,在培养第7 d后能形成具有隐窝-绒毛样结构的肠小体。分别采用MOI 1、0.1和0.01 TGEV感染肠小体后,通过荧光定量PCR(qPCR)方法检测TGEV在肠小体中的复制情况,结果显示肠小体支持TGEV复制;进一步用MOI 1 TGEV感染肠小体后,通过qPCR检测并绘制TGEV在肠小体中的病毒复制曲线,结果显示,与2 hpi相比,在12 hpi病毒的mRNA转录水平增加了321倍,在24 hpi病毒复制达到峰值;通过间接免疫荧光(IFA)检测TGEV N蛋白的表达,结果显示N蛋白的表达情况与上述mRNA检测结果相符。通过双荧光标记IFA检测TGEV N蛋白与肠上皮细胞类型标志物的共定位情况,结果显示TGEV能感染多种肠上皮细胞类型,包括肠细胞、干细胞和杯状细胞。此外,通过qPCR检测TGEV感染肠小体的干扰素(IFN)mRNA转录水平,结果显示TGEV感染肠小体能显著增加IFN的产生。以上结果表明肠小体对TGEV易感,肠小体可以作为TGEV感染的体外细胞模型。本研究为探究TGEV与宿主之间的相互作用提供了一个全新的体外细胞模型,将有助于深入理解TGEV的致病机制。     

蜂胶黄酮对PK-15细胞感染PPV与TGEV产生抗感染因子的比较

为了研究蜂胶黄酮对宿主细胞感染不同结构病毒后产生抗感染因子的影响,将蜂胶黄酮从最大安全质量浓度250mg/L倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis of pigs virus,TGEV)、细小病毒(porcine parvovirus,PPV)分别一起加至长成单层PK-15细胞培养体系中,ELISA法测定蜂胶黄酮对TGEV或PPV感染PK-15细胞后产生IFN-β、IFN-γ和iNOS抗感染因子的含量。结果显示,与病毒对照组比较,在感染TGEV后2,12h的前期,蜂胶黄酮可以显著提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS含量的能力;在感染PPV后2,12h的前期,只有较高质量浓度的蜂胶黄酮可以提高PK-15细胞产生IFN-β、IFN-γ和iNOS含量的能力。PK-15细胞在感染病毒后24,48和72h,蜂胶黄酮对提高TGEV感染PK-15细胞后产生抗感染因子能力高于PPV。蜂胶黄酮提高有囊膜的TGEV感染宿主PK-15细胞产生抗感染因子能力高于无囊膜的PPV。     

MCPIP1基因影响牛病毒性腹泻病毒复制机制的研究

MCP-1诱导蛋白(MCPIP1)可以作为转录因子激活凋亡相关基因的转录、抑制炎症相关基因启动子的激活和诱导细胞分化、血管生成,前期研究发现牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染造成MCPIP1基因的表达显著上调。为了进一步研究MCPIP1基因对BVDV复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立MCPIP1基因敲除的MDBK细胞MCPIP1 KO,测序分析MCPIP1基因的敲除效率,结果显示,成功敲除MDBK细胞的MCPIP1基因,敲除效率约70%。利用western blot检测MCPIP1表达情况,结果显示MCPIP1 KO细胞中MCPIP1蛋白的表达显著降低;测定MCPIP1 KO生长曲线结果显示,MCPIP1 KO与对照组Scramble细胞及MDBK细胞的生长情况相比未发生明显变化;将BVDV TC株感染MCPIP1 KO细胞和对照组Scramble细胞,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测BVDV 5'UTR mRNA水平,结果显示,与对照组Scramble相比,BVDV感染MCPIP1 KO细胞24 h～120 h时BVDV5'UTR mRNA含量显著降低;采用免疫荧光染色检测BVDV双链RNA含量(dsRNA),结果显示感染12 h后红色荧光标记的dsRNA数量明显减少;观察BVDV致细胞病变(CPE)效应情况,并且收集细胞培养液冻融后利用ReedMuench法测定病毒滴度变化,结果显示,感染36 h后对照组出现大量CPE并脱落,MCPIP1 KO组CPE效应明显低于对照组并且BVDV滴度显著降低。以上结果表明敲除MCPIP1基因显著抑制BVDV的复制,本研究为抗BVDV新方法的建立提供新的思路和药物作用靶点。     

猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N (pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响，本研究检索并分析p APN与TGEV的结合位点，结果显示，敲除p APN aa668～aa963对其酶活性无影响。因此，利用CRISPR/Cas9技术构建p APN与TGEV结合位点敲除细胞系，经PCR和western blot鉴定结果显示，正确构建一株敲除p APN aa668～aa963的ST细胞系，即敲除p APN 15-21外显子，命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性，结果显示，敲除p APN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-q PCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达，结果显示，敲除p APN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-q PCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化，结果显示，TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3 (NOD-...     

抗伪狂犬病病毒干扰素刺激基因的筛选及IFIT3抗病毒活性的鉴定

为研究抗伪狂犬病病毒(PRV)特异性的干扰素刺激基因(ISGs),本研究采用与表达增强型绿色荧光蛋白报告病毒相结合的高内涵筛选系统对具有抗病毒功能的10种ISGs进行筛选,之后利用过表达细胞系、间接免疫荧光(IFA)和qRT-PCR试验对显著抑制PRV复制的IFIT3(<0.01)进行抗病毒活性验证,通过qRT-PCR检测了PRV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)和PRV感染猪的外周血单核细胞(PBMC)中IFIT3mRNA的转录水平。高内涵筛选结果显示,5种潜在的抗PRVISGs分子(IFIT3、ISG15、GBP2、Mx1和ISG20)对PRV的复制具有显著的抑制作用,其中IFIT3效果最显著;IFA和qRT-PCR试验结果显示,在PK-15细胞和PAM中,过表达IFIT3均可以显著降低PRV-TJ株的病毒滴度和基因组拷贝数;qRT-PCR试验结果显示,在PRV感染的PAM和PBMC中,IFIT3mRNA的转录水平均显著上调。流式细胞术试验表明过表达IFIT3不影响PK-15细胞凋亡,推测IFIT3可能存在其它的抗病毒机制。本研究筛选到5种潜在的抗PRVISGs并证实IFIT3是一种抗PRV的ISG,为抗PRVISGs的相关研究,特别是猪源IFIT3抗病毒机制的研究奠定了基础。     

猪A型塞内卡病毒感染诱导猪肾细胞(PK-15)长链非编码RNA差异表达谱的分析

为研究猪A型塞内卡病毒(SVA)感染猪肾细胞(PK-15)后对于PK-15 lncRNA表达谱的影响,本研究进行了高通量测序以检测SVA感染诱导PK-15产生的差异表达lncRNA。结果显示,在SVA感染后24 h,共诱导1043个lncRNA差异表达,其中已知的lncRNA 420个,未知的lncRNA 623个。GO富集和KEGG通路分析显示,lncRNA靶基因富集于p53信号通路、RIG-I样受体信号通路、MAPK信号通路、IgA生成的肠道免疫网络通路等。根据高通量测序结果选择了8个差异表达的lncRNA采用荧光定量PCR验证,验证结果与高通量测序结果一致。本研究初步表明lncRNA参与了SVA对PK-15细胞的感染过程,为SVA的分子机制研究提供了新的方向。     

猪细小病毒感染PK-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析

为了解猪细小病毒(PPV)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主一病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR 2、MHC-I、MHC一Ⅱ、MX1、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF-3的转录水平.结果显示,PPV感染PK-15细胞12h病毒开始大量迅速增殖,48 h达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-Ⅱ、Mxl、iNOS、2-5AS、RNase I.和IRF-3的转录量显著增加,其中Mχ1基因在24 h转录量达到8 423倍.猪细小病毒感染可引起PK-15细胞抗病毒相关因子转录增加.     

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15,ISG15）敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG15基因敲除猪肾上皮（PK-15）细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15^-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP0、PRV-gE、PRV-VP16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15^-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。     

凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响.以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)A SC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细...     

猪Beclin1基因调控伪狂犬病病毒诱导细胞自噬和凋亡的机制分析

旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)感染后细胞自噬和凋亡情况,进一步分析鉴定PRV感染条件下与Beclin1互作的猪宿主凋亡家族蛋白。利用免疫印迹(WB)方法检测PRV感染细胞的自噬水平;利用流式细胞术探讨凋亡水平;最后利用免疫共沉淀试验分析PRV感染PK-15细胞中Beclin1与Bcl-2和Bcl-xL的结合水平。结果显示,PRV感染导致LC3-Ⅱ的表达明显增多,而P62显著下降,且AKT(S473)磷酸化水平显著减少;其次,PRV感染诱导细胞凋亡且显著上调剪切型Caspase-9/8的表达水平;最后,免疫共沉淀结果显示PRV感染条件下Beclin1能与Bcl-2和Bcl-xL结合,但结合的水平明显降低。PRV感染诱导的细胞自噬可能依赖于PI3K-Ⅰ/AKT信号通路,PRV感染可能同时激活了线粒体凋亡途经和死亡受体途经从而诱导细胞凋亡,而PRV感染诱导的细胞自噬和细胞凋亡可能通过抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL结合而相互关联。     

禽白血病病毒J亚群感染DF-1细胞后错配修复相关基因转录水平变化的研究

为研究禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染DF-1细胞后错配修复相关基因MMR、BRCA1和p53mRNA的转录水平变化,本研究将ALV-J NX0101株接种DF-1细胞,感染7 d后检测ALV-p27抗原,确定病毒感染是否成功。然后提取细胞中总RNA,采用荧光定量PCR以β-actin基因作为内参对MMR(MSH2、MSH3、MLH1和PMS1)、BRCA1和p53基因的mRNA转录情况进行检测。结果表明,与正常对照细胞比较,病毒感染细胞中的MMR(MSH2、MSH3、MLHl和PMSl)和p53基因的mRNA转录水平升高,而BRCA1基因的mRNA转录水平降低。表明在ALV感染宿主细胞后MMR(MSH2、MSH3、MLHl和PMS)、BRCA1和p53参与了宿主细胞DNA损伤的识别及修复过程,这一结果为ALV的致瘤机理的研究提供了新的思路。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡

塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过Annexin V-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,Annexin V-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Western blotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。     

靶向TGEV S基因的外源性microRNA对TGEV增殖效果的抑制

本研究利用生物信息学软件对TGEV S基因进行分析,筛选出可能与S基因有相互作用的外源miRNA:amiRNA-S-28035、amiRNA-S-28038、amiRNA-S-28165。利用脂质体将构建好的相应表达载体瞬时转染至PK-15细胞;通过Q-PCR和间接免疫荧光方法检测其对S基因的抑制作用;CPE分析和TCID50测定检测其对TGEV增殖的抑制效果。结果发现,3个外源性miRNA均降低了S基因mRNA的转录和蛋白的表达,其中amiRNA-S-28038对TGEV mRNA的平均抑制率可达64.6%,最高可达69.9%,表明外源性microRNA可以通过靶向TGEV基因组来抑制TGEV的复制。研究结果为猪传染性胃肠炎的预防和治疗提供了新的思路。