猪细小病毒感染PK-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析

为了解猪细小病毒(PPV)感染后引起干扰素及其相关细胞因子的反应,探讨宿主一病毒之间的作用关系,作者运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞引起的病毒DNA量的变化和细胞因子IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR 2、MHC-I、MHC一Ⅱ、MX1、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF-3的转录水平.结果显示,PPV感染PK-15细胞12h病毒开始大量迅速增殖,48 h达到最高峰;PPV感染后可引起PK-15细胞中IFN-β、IFN-γ、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-Ⅱ、Mxl、iNOS、2-5AS、RNase I.和IRF-3的转录量显著增加,其中Mχ1基因在24 h转录量达到8 423倍.猪细小病毒感染可引起PK-15细胞抗病毒相关因子转录增加.     

蜂胶黄酮对病毒诱导PK-15细胞凋亡的影响

为研究蜂胶黄酮对病毒诱导宿主细胞凋亡的影响,将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL倍比稀释5个浓度,与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪细小病毒(PPV)分别一起加至单层PK-15细胞培养体系中,用流式细胞仪检测蜂胶黄酮对TGEV和PPV感染PK-15细胞凋亡率的影响。结果显示,与病毒对照组比较,TGEV和PPV感染PK-15细胞后,蜂胶黄酮可以显著降低PPV感染引起的PK-15细胞凋亡率,而对TGEV感染引起的PK-15细胞凋亡率则没有显著影响。说明蜂胶黄酮可以减轻无囊膜的PPV感染对PK-15细胞引起的凋亡。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡

塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过Annexin V-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,Annexin V-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Western blotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。     

传染性法氏囊病毒诱导的细胞凋亡及相关细胞因子的变化

传染性法氏囊病毒是传染性法氏囊病的病原体,能引起雏鸡淋巴组织的坏死、萎缩及免疫抑制。该病毒在世界范围内普遍存在,并有多种的变异株、强毒株出现,给养鸡业造成巨大损失。近些年传染性法氏囊病毒与细胞凋亡的关系不断受到学者高度关注。研究表明,病毒感染后B淋巴细胞发生凋亡,可能是病毒引起免疫抑制的主要原因,而VP2蛋白是该病毒主要凋亡因子。本文对传染性法氏囊病毒的生物学特征、病毒与细胞凋亡关系及某些相关细胞因子变化等研究进展做一简要综述。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因在昆虫细胞中的表达

为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪的传染性胃肠炎病毒

传染性胃肠炎(TCE)是一种高度传染的病毒性的猪肠道疾病,2周龄前的小猪感染后死亡率十分高。在美国中西部猪繁殖密集的地区,传染性胃肠炎是幼年小猪腹泻和死亡的主要原因之一。虽然这种病毒通过实验接种后可以从狗、狐和八哥鸟中分离出来,并在狗体中可测得传染性胃肠炎的抗体,但除猪之外尚未发现其他动物发病。在美国,该病主要发生在冬季。这可能是由于(1)病毒在冷天比暖热天气活得较     

猪传染性胃肠炎病毒组织培养的研究

<正> 为了研究猪传染性胃肠炎(简称TGE)病毒对几种细胞培养的适应性,我们将日本的SH株和TO株,除了用猪肾细胞和小猪甲状腺细胞培养外,又用猪肾传代细胞(IB-RS-2)分离培养了病毒。现将研究结果叙述于下。     

SPA-ELISA监测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体水平的研究

建立了SPA—ELISA监测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)血清抗体水平的方法，与免疫荧光试验(IFA)符合率高达90．9％。试验表明：病毒抗原最适包被浓度为4μg／ml；血清工作浓度为1：200；最佳包被液采用0．05m pH9．6的碳酸缓冲液；封闭液选用2％的脱脂奶；并确定了抗原抗体最佳反应时间和最适反应温度及底物溶液的显色时间。特异性试验表明所组装的SAP—ELISA试剂盒特异性较好，可用于TGE的流行病学调查。     

PK15、ST细胞增殖猪传染性胃肠炎病毒的比较研究

<正>猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病[1-2]。该病是我国及世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要传染病之一,尤其是在冬季和早春寒冷季节常呈地方性爆发流行,给养猪业造成极大危害[3-4]。为了预防TGE的发生与流行,国外已先后培育出多株猪传染性胃肠炎病毒弱毒疫苗株,并研制成TGEV弱毒疫苗,用于TGE的免疫     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的克隆及其结构特征

参照GenBank中登录的TGEVS基因序列设计了3对特异引物，经RT-PCR扩增获得了TS株S基因的SⅠ、SⅡ和SⅢ3个片段，其大小分别约为1262、2368和1266bp。SⅠ、SⅡ和SⅢ片段经剪接后，可知TS株的S基因全长为4347nt，共编码1449个氨基酸。对TS株与其他毒株的S基因序列进行比较发现，TS株与Miller株、FS722／70株、TGEVH株、961933株、TFI株均在1124～1129位有5′-ATGATA-3′六个碱基，而在Purdue株、TH-98株、NEB72RT株和PRCV-HOL87株中缺失；TS株与Miller株、FS722／70株、TFI株、Purdue株、96-1933株、TGEVH株、TH-98株、NEB72-RT株和PRCV-HOL87株的核苷酸序列同源性分别为99．69／6、98．9％、98．0％、98．3％、95．7％、99．3％、97．7％、98．3％和97．5％。推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％、98．4％、97．7％、97．8％、94．8％、98．6％、97．2％、97．7％和97．0％；TS株S蛋白的推导氨基酸序列较Purdue株、TH-98株和NEB72-RT株多出2个潜在的糖基化位点，共34个。与不同毒株比较后，推测在TGEV的S蛋白中第71位的Asp(D)与呼吸道嗜性有关，第219位的Ala(A)与肠道嗜性有关。     

RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究

根据GenBank发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突蛋白S基因的5′端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增的目的片段长度为690bp。在优化RT-PCR反应条件的基础上,建立了TGEV的RT-PCR检测方法。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠体液免疫功能变化的研究

本实验对TGEV S基因核酸疫苗免疫后体液免疫功能变化进行了研究,同时比较了两种核酸疫苗单独免疫小鼠后体液免疫应答的变化,证明重组核酸疫苗诱导小鼠产生体液免疫应答。     

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。     

锰中毒诱导鸡肝细胞凋亡及细胞内Fas基因mRNA转录分析

为初步探讨染锰对公鸡肝细胞凋亡的影响,将400只50日龄海兰褐公鸡随机分为4组,分别在饲料中添加0、600、900、1 800 mg·kg~(-1) MnCl_2建立亚慢性锰中毒模型,于染毒第30、60、90天采取肝脏观察肝细胞形态学变化,检测肝细胞凋亡指数以及分析Fas mRNA的转录水平.结果显示,在第90天时,高剂量组与对照组相比,锰中毒诱导出现典型凋亡形态变化,随着染毒剂量的升高,凋亡细胞的数量逐渐增多;不同时间点,随着染锰剂量的增加,Fas基因mRNA转录水平基本呈升高趋势.     

猪圆环病毒2型感染PK-15细胞差异表达miRNA和mRNA互作网络

旨在筛选猪圆环病毒2型感染猪肾上皮细胞(PK-15)后差异表达miRNA和mRNA,并探究miRNA和mRNA之间的互作关系。使用茎环定量PCR检测多个热点miRNA在PCV2感染组和未接种病毒组之间的差异表达水平以发现差异表达miRNA,分析PCV2感染后第12小时的蛋白质组学研究结果(GEO登录号:GSE71945)以获得差异表达mRNA,并分析差异表达miRNA和mRNA之间的互相作用关系。结果显示,在PCV2感染后第12小时miR-10b、miR-128、miR-155-5p、miR-21、miR-29b、miR-361-3p等表达量显著性变化,使用miRecords预测其靶基因,分别发现7 105、9 741、7 451、7 183、7 971、8 793个靶基因;PCV2感染后第12小时共有158个差异表达mRNA,分属于多种细胞结构成分并参与多条重要的细胞生物途径,且差异miRNA的靶基因和差异mRNA之间有大量的交集基因。上述结果表明,PCV2感染能导致细胞内多种miRNA差异表达,造成miRNA的靶基因表达紊乱,进而影响细胞正常的生命进程。     

稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列（Kozak,1987）,定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。