赤羽病病毒的纯化及其单克隆抗体的制备

将人工繁殖、纯化的赤羽病病毒作为免疫原,通过常规杂交瘤技术,制备亲和性强、特异性好的小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体,并进行相应的纯化和标记工作。以澳大利亚进口的试剂盒进行验证,结果证明:进口单抗与我们制备的AAK纯品及AAK-HRP显示同样结果;且质控结果表明,AAK纯品及其衍生物AAK-HRP的特异性和亲和性均基本满足进行封闭ELISA检测方法的要求,为制备国产化ELISA试剂盒提供了基础。     

赤羽病和赤羽病毒

<正> 1972—1973年入夏以后日本关东以西许多牛发生流产,早产,死胎,先天性关节弯曲和脑水肿。此病流行范围不宽,但时间较长,一直延续到75年,病牛约有4万余头。该病八月份后开始增多,十二月到次年元月     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒N蛋白广谱单克隆抗体的制备与鉴定

为制备能与多种基因型传染性支气管炎病毒(IBV)反应的广谱性单克隆抗体,反应谱能够覆盖当前在国内流行的主要优势基因型毒株.通过RT-PCR克隆了QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株N基因,分别插入原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6P-1构建了重组质粒pET-N和pGEX-N,并在大肠杆菌中进行原...     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的重组PEDVN蛋白为抗原免疫7周龄雌性BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术获得了7株稳定分泌抗重组N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为9C1、7H8、3C10、6C4、10G9、2C10和483。7株杂交瘤细胞诱导小鼠产生的腹水抗体效价分别为1：3200、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：6400和1：12800。9C1、7H8、3C10、6C4、10G9和2C10免疫球蛋白类型均为IgM,轻链均为K链;483免疫球蛋白类型为IgG2a,轻链为K链。Westernblot试验结果显示,这7株单克隆抗体均能与天然的PEDVN蛋白发生反应。     

抗尼帕病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗尼帕病毒(NiV)的单克隆抗体(Mib),本研究以原核表达并纯化的NiV核蛋白(N蛋白)为免疫原,按常规方法免疫小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经两次有限稀释法克隆,最终获得两株稳定分泌抗N蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为A6和C5.Western blot分析表明....     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用RT-PCR扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因并克隆至原核表达载体pET-28a,转化到宿主表达菌BL21后经IPTG诱导表达和Ni柱纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组N蛋白,其大小约为58 ku。将纯化重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合,PEDV间接ELISA方法筛选,制备获得4株能稳定分泌PEDV抗体的杂交瘤细胞株1C9、4C8、4F8和6A11。Western blot和间接免疫荧光试验证明其与PEDV均有特异性反应,单抗亚类鉴定均属于IgG1,轻链为κ型。杂交瘤细胞培养上清ELISA抗体效价为1∶1 600~6 400,腹水ELISA抗体效价达1∶1.024×105以上;4株细胞连续培养20代,其ELISA抗体效价基本一致。本研究为PEDV感染的诊断和致病机制研究提供了有用工具。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)的单克隆抗体,本实验以重组PEDV-N蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,经过3～5次亚克隆与筛选,获得了4株分泌抗PEDV McAb的杂交瘤细胞,分别命名为4A7、6C1、5E10和6F7。4株杂交瘤细胞分泌的McAb均为IgM,其轻链均为κ链。ELISA、Western Blot和免疫荧光鉴定结果表明,4株单抗均与N蛋白及PEDV具有良好的结合活性。复苏冻存的4株杂交瘤细胞,连续传代培养30代,4株杂交瘤细胞能够持续稳定分泌抗体,细胞上清的ELISA抗体效价均在1∶800以上。4株细胞诱生的小鼠腹水抗体效价为1∶10~5～1∶10~6。将单克隆抗体(4A7)用于免疫组化试验和IPMA时,其能够特异地识别PEDV人工感染猪小肠组织和Vero细胞内的病毒。上述实验结果表明,制备的单克隆抗体可以用于PEDV抗原检测以及体内病毒的组织定位分析,并可为进一步研发PEDV抗原或抗体检测技术奠定基础。     

赤羽病病毒Gcaa465～704的杆状病毒表达和单克隆抗体制备

为制备针对赤羽病病毒(AKAV)糖蛋白Gc的单克隆抗体(mAb),本试验选取AKAV Gc蛋白第465～704位氨基酸的基因序列进行密码子优化并合成至pFastBac HTB载体;通过蓝白斑筛选和昆虫细胞杆状病毒表达系统制备重组AKAV Gc_aa465～704蛋白,纯化后免疫小鼠;通过细胞融合和亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞,利用Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)对mAb特性进行鉴定。结果显示,本试验成功筛选出1株可稳定分泌抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb的杂交瘤细胞株4D1,Western blot结果显示,mAb 4D1可特异性识别AKAV Gc_aa465～704蛋白;IFA结果显示,mAb 4D1能够与AKAV感染的BHK21细胞发生反应。结果表明,本试验成功制备抗AKAV Gc_aa465～704蛋白mAb,为进一步研究AKAV Gc蛋白生物学功能和建立AKAV检测方法提供技术支持。     

抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定

为建立抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的单克隆抗体(MAb),利用浓缩的IBV致弱株CK/CH/LDL97Ⅰ F115病毒免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA和有限稀释法,经筛选和克隆后获得了一株抗IBV N蛋白MAb的杂交瘤细胞系(2D2).经鉴定,其MAb的重链为lgG<.1>亚型,轻链为κ链.ELISA和westernblot试验结果表明,所获得的这株2D2 MAb可特异性识别IBV N蛋白.2D2 MAb可与多种血清型IBV发生反应,表明该MAb识别的表位可能位于N蛋白的保守区域.为进一步鉴定IBV的表位及诊断试剂的研究奠定了基础.     

裂谷热病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

裂谷热(RVF)是由裂谷热病毒(RVFV)引起的一种人兽共患传染病,主要由蚊媒传播.该病主要感染反刍动物,可引起流产和新生胎儿死亡,人类对该病也易感,严重者可导致死亡.对于无RVF的国家,建立相应的病原学与血清学检测方法对于防止该病传入至关重要.为了建立基于病毒N蛋白的诊断技术,本研究构建了裂谷热病毒N基因原核表达质粒...     

抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B5为IgG2a亚类,杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶800和1∶32 000,连续培养20代后能稳定分泌抗体。     

赤羽病病毒的电镜观察

赤羽病病毒（Ａｋａｂａｎｅｖｉｒｕｓ,ＡＫＶ）是牛、羊赤羽病的病原,在孕畜可引起流产、早产、死胎、新生犊畸形以及大脑缺损〔１～５〕。自从１９６１年Ｏｙａ〔６〕等从日本群马县赤羽村的畜舍内采集的金色库蚊和三带喙库蚊中首次分离出Ａｋａｂａｎｅ病毒以来,澳...     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备

为制备新城疫病毒HN蛋白的单克隆抗体,本研究采用新城疫病毒CK/AH/100/2010作为免疫原,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0融合,用血凝抑制(HI)方法检测筛选,具有HI活性的单抗有6株:PX1-PX6。6株单抗与AIV、EDS等其它具有血凝活性的病毒的交叉血凝抑制试验结果表明,6株单抗具有良好的特异性。间接免疫荧光试验结果表明,PX1、PX3可与新城疫病毒CK/GD/263/2010 HN抗原发生特异性反应,而其它单抗不反应。     

赤羽病病毒N基因硫氧还蛋白融合表达载体的构建与表达

为获得赤羽病病毒(Akabane virus，AKAV)的核蛋白重组抗原，根据其基因序列(S mRNA)设计合成了1对特异性引物，对AKAV N基因进行RT-PCR扩增，产物大小约为696bp，回收纯化后，将其克隆至pMDl8-T质粒栽体中，经核苷酸序列分析，与已报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白N的S mRNA基因比较后发现，所测定毒株的核苷酸序列与TIN毒株的同源性高达98．3％，推测的氨基酸同源性为97．6％，证实为AKAV的N基因。将该基因片段亚克隆插入pBAD／Thio TOPO表达栽体，转化TOPl0细胞，成功地构建了AKAV N基因重组表达栽体。经L-araboinose诱导表达，可稳定、高效地表达AKAV核蛋白抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约42．5ku，其表达产量约占茵体总蛋白的28％，融合蛋白中含有AKAV特异性核蛋白抗原，可作为ELISA包被抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原,为了解析该病毒N蛋白抗原表位,本研究制备获得纯化的重组N蛋白,经过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA方法筛选和Western blot鉴定,获得了7株稳定分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,细胞培养上清液抗体效价为1∶800～1∶25 600,其中8F1、5E2、2B1、12E1的重链类型为IgG1,4F1、2H2、5A2的重链类型为IgG2b,轻链类型都为κ型。间接免疫荧光试验显示7株单克隆抗体均与PRRSV感染细胞产生反应,可识别3种不同的B细胞线性表位,分别位于47～57 aa、57～67 aa及67～77 aa区域,其中57～67 aa为新发现的抗原表位。本研究结果为PRRSV诊断试剂盒的开发和流行病学调查提供了有用工具。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒N蛋白单克隆抗体制备及表位鉴定

为制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)N蛋白的单克隆抗体,本研究构建了pET-32a-N重组质粒,原核表达并纯化重组N蛋白,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后利用间接ELISA进行筛选,获得了3株稳定分泌的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2C3、4F3、5C6。Western blot与间接免疫荧光试验表明,3株单抗均能与293T细胞中表达的N蛋白产生特异性反应。经测定,3株单抗的效价均为1×10⁶,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ。利用一系列表达的部分重叠的N截短蛋白片段,经Western blot鉴定单抗所识别的抗原表位,结果显示,²⁶⁷KPRQK²⁷¹为单抗2C3、4F3、5C6所识别的表位。本研究为PHEV临床检测方法的建立和表位疫苗的研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

本研究旨在采用原核表达系统表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的核衣壳蛋白(N),并进一步制备其单克隆抗体。将构建重组原核表达质粒pET28a-N转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白,并采用Ni-NTA亲和层析和分子筛进行纯化。将纯化后的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其分泌抗体的特性进行了分析。结果显示:重组质粒pET28a-N在E.coli BL21中高效表达,筛选获得了2株稳定分泌抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A3和4F6,其分泌的抗体均为IgG1亚型,腹水效价分别为5.12×10~5、1.28×10~5。本研究为进一步研究N蛋白的功能以及建立PEDV免疫学诊断方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SX-1株N蛋白单克隆抗体的制备

<正>用纯化的重组HIS标签N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb),经细胞融合获得5株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞1A12,3F11,5A3,5F9,4E4。其中1A12,3F11,5A3,4E4杂交瘤上清与HIS-N蛋白与GST-N蛋白两种抗原包被的ELISA反应均为阳