油茶CYP78A10同源基因及其SSR位点

拟南芥(Arabidopsis thaliana)CYP78A亚基因家族基因参与种子大小的遗传控制.对普通油茶(Camellia oleifera)转录组数据进行挖掘,从花蕾和根转录组数据中分别得到1条CYP78A10的同源基因,再从油茶基因组三代测序数据中鉴别出其基因组DNA序列,最后,得到2条油茶CYP78A10同源基因全长CDS序列,分别命名为CoCYP78A10a、CoCYP78A10b.用植物CYP78A亚基因家族基因的蛋白质序列构建进化树,结果表明,CoCYP78A10a、CoCYP78A10b与CYP78A10、GmCYP78A10在一个分支,可能参与油茶种子大小的调控.通过SSR位点信息分析,在CoCYP78A10a第1外显子5'端非翻译区、CoCYP78A10b的启动子区分别发现1个适宜进行SSR分子标记开发的多态性位点.     

油茶种子数量相关基因EPFL2的鉴别

拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtEPFL2基因属于EPF/EPFL基因家族中的EPFL1/2/3亚家族,与种子数量有关.对普通油茶(Camellia oleifera)幼叶、未成熟种仁、花蕾、根的转录组数据进行挖掘,得到3条油茶EPFL2基因序列;从油茶基因组3代测序数据中鉴别出含有前述3条序列的基因组DNA序列;最后,得到3条油茶EPFL2基因全长CDS序列,分别命名为CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c.用MEGA7构建EPFL1/2/3亚家族蛋白质系统进化树,结果表明:CoEPFL2a、CoEPFL2b、CoEPFL2c属于EPFL2分支,并且CoEPFL2a、CoEPFL2c与AtEPFL2在同一个亚分支.用SignalP-5.0预测蛋白信号肽与酶切位点,结果表明:AtEPFL2、CoEPFL2c含信号肽与酶切位点,CoEPFL2a、CoEPFL2b不含;CoEPFL2c可能与AtEPFL2具有同样的功能,即通过调节胚珠密度影响种子数量.     

杏RPW8基因家族鉴定与表达量分析

RPW8(Resistance to powdery mildew 8)不但对拟南芥白粉菌有抗性作用,同时也对烟草白粉菌、拟南芥霜霉菌和烟草花叶病毒等多种植物寄生性病原体都表现出较高的抗性,具有广谱抗病性。以杏全基因组数据为基础,鉴定RPW8家族成员,分析基因家族特点及不同组织中表达量分析,有利于更加深入了解RPW8基因家族功能,为杏抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育种提供理论参考。通过SMS、GSDS2.0、Expasy-protparam、MEME、MAGA6.0、TBtool等生物信息学工具对RPW8基因家族的核酸序列的特征、基因结构、蛋白质理化性质、蛋白保守结构域、家族系统进化关系、表达量等进行分析和预测。结果表明:从杏中共鉴定出16个RPW8家族基因,分别命名为LWMRPW8-1～LWMRPW8-16,内含子数量小于6个,16个基因的全长为360～4 864 bp,碱基G+C含量为37.39%～46.89%,碱基A+T的含量为53.11%～62.61%;杏RPW8基因家族编码的氨基酸分子量为13 653.93～92 617.92 Da,理论等电点为5.42～9.47,蛋白质不稳定性指数为22.94～61.18,氨基酸组成成分以亮氨酸(Leu)赖氨酸(Lys)为主;保守结构域分析结果显示杏RPW8家族主要含有10个Motify,其中Motif8、Motif9为特征结构域;系统进化树分析显示,蔷薇科植物RPW8家族基因聚为一类,LWMRPW8-7与拟南芥、杨树基因聚为一类。对杏RPW8基因在不同组织中的表达分析结果显示,16个基因在花、花芽、叶片、果肉、果仁中的表达量呈现较大差异。     

14个油茶良种遗传多样性的SRAP分析

对14个油茶良种进行SRAP标记(序列相关扩增多态性)的遗传多样性分析。采用改良CTAB法提取的油茶叶片基因组DNA为模板,利用优化的SRAP-PCR反应体系,从16个正向引物和20个反向引物中筛选出条带特异、多态性好、稳定性高的8对引物组合。利用这些引物组合对14个油茶良种扩增出65条清晰可重复的条带,其中22条是多态性条带,多态性条带百分率为33.85%。通过生物学软件对所得数据进行遗传学分析,计算出遗传相似系数,绘制出分子聚类图,为油茶良种的后续分子鉴定及分子育种提供了科学基础。     

毛白杨α-微管蛋白基因家族的克隆与序列分析

采用本地化软件BlastP对杨树全基因组数据库和GenBank数据进行搜索,根据搜索结果对毛白杨TUA基因家族进行克隆,并利用软件Clustal W和MEGA对TUA基因进行了核酸和氨基酸序列的比对分析和系统进化分析;利用SWISS-MODEL服务器对TUA的蛋白质三维结构进行模拟。结果显示:毛白杨α-微管蛋白由8个成员构成,8个成员的氨基酸序列和其它植物α-微管蛋白序列的相似性在80%以上;TUA基因可分为2个家族,每个家族成员都有其独特的内含子外显子特征;TUA蛋白的三维结构表现出极高的相似性。毛白杨TUA基因在序列和结构上都十分保守;8个TUA基因起源于2个祖先TUA基因。     

铁皮石斛phytocyanin基因家族全基因组分析

[目的]探讨Phytocyanins(PCs)在铁皮石斛发育过程和逆境胁迫环境下的潜在功能。[方法]利用拟南芥和水稻phytocyanin基因家族蛋白序列(At PCs和Os PCs),采用本地化软件BLASTP对铁皮石斛全基因组数据库进行搜索,并采用SMART和pfam数据库验证质体蓝素样结构域,获得铁皮石斛phytocyanin基因家族编码序列(Do PCs);利用Signal P4.1、Big-PI Plant Predictor、Net NGlyc1.0 Server等在线软件对Do PC家族序列的结构特点进行分析;利用软件Clustal W和MEGA对Do PC基因进行氨基酸序列的比对和系统进化分析;利用转录组数据绘制heatmap图对Do PCs基因在与美孢胶膜菌共生萌发的种子中的表达情况进行分析。[结果]显示:铁皮石斛全基因组中共预测到包含PCLD结构域的38个Do PCs,可分属4个亚家族,2个Cys残基在Do PCs家族中高度保守;19条Do PCs蛋白序列含有4个完整的保守铜结合配体(His、Cys、His、Gln/Met),有32条Do PCs骨架中含有N-端信号肽,22条Do PCs含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点,有27条Do PCs含N-糖基化位点;16个Do PCs基因在与美孢胶膜菌共生萌发的种子中检测到表达,其中,Do UCL2,4和Do ENODL14基因表达量最高,7个基因在共生萌发的种子中明显上调表达,只有Do ENODL6基因明显下调表达。[结论]在全基因组范围内分析铁皮石斛Do PC家族蛋白结构特点,可以为探究兰科植物与微生物共生的相互作用及进一步研究兰科菌根形成的分子机制提供数据基础。     

两种兰科植物CaM及CML基因家族全基因组分析

[目的]探讨Ca M和CML基因家族在兰科植物不同组织和与菌根真菌建立共生关系过程中的潜在功能。[方法]依据已发表的拟南芥Ca M和CML基因家族蛋白序列,利用生物信息学方法对小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组进行搜索,通过多种生物软件或在线工具对Ca M和CML基因家族蛋白序列进行筛选及确定、蛋白结构分析、系统进化分析及结构域预测;利用转录组数据绘制heatmap图,对小兰屿蝴蝶兰不同组织(花、叶、茎、根)及石斛种子与美胞胶膜菌共生条件下Ca M和CML基因家族的表达情况进行分析。[结果]在小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛全基因组中均预测到4个Ca M蛋白和54个CML蛋白;小兰屿蝴蝶兰Ca M及CML家族基因中39个基因没有内含子,19个基因具有内含子;铁皮石斛Ca M及CML基因家族中有41个基因没有内含子,17个基因具有内含子;系统进化分析将小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛Ca M和CML蛋白家族各分为10个亚家族;小兰屿蝴蝶兰中9个基因在叶中的表达相对于花、茎、根为上调表达,2个基因在叶中的表达相对于花、茎、根却为下调表达; 3个基因在花中的表达相对于叶、茎、根为上调表达; 3个基因在花和叶中的表达相对于茎和根为上调表达;铁皮石斛中4个基因在与美胞胶膜菌共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为上调表达; 4个基因在共生萌发文库中的表达相对于非共生文库为下调表达。[结论]Ca M及CML家族基因在兰科植物不同组织具有重要作用,且参与铁皮石斛种子与美孢胶膜菌共生萌发的生物学调控过程。     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

桑树MLX56基因家族特性、克隆及表达分析

【目的】桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。从桑树基因组数据库中鉴定桑树MLX56基因家族,并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析,为桑树MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。【方法】利用桑树基因组数据库,采用生物信息学方法,分析桑树MLX56基因家族结构及进化关系,并对MLX56基因家族成员进行鉴定;利用MEGA4.1软件进行系统进化树分析;通过半定量RT-PCR技术研究MLX56基因在桑树不同种及不同组织之间的表达水平,构建原核表达载体p ET-28a-MLX56-6,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段的菌液进行超声破碎,SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性;利用Western Blot印迹验证目的蛋白的表达。并研究该基因对大肠杆菌生长速率的影响。【结果】利用桑树基因组数据库,鉴定6个MLX56家族基因,该家族基因含有2个几丁质结合域,且都含有信号肽,属于分泌蛋白。此外还克隆到1个新的MLX56基因,命名为MLX56-7(Gen Bank登录号为KJ496133)。系统进化树显示桑树MLX56基因与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高,同源性达66%,与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低,同源性分别为49%和48%。半定量RT-PCR分析表明,MLX56-1,MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7在桑树不同种中均有表达,组织表达特异性分析表明MLX56-2,MLX56-4,MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都有表达,MLX56-1基因仅在叶柄及茎中表达,MLX56-3基因在桑树不同种及广东桑‘桂优62号’各个组织中都没有检测到表达。原核表达结果表明,MLX56-6蛋白在终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG诱导下成功表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了1个分子量为56 k Da的蛋白。但在诱导表达过程中,大肠杆菌BL21(DE3)生长速率受到MLX56-6基因的抑制。【结论】MLX56基因家族在桑树进化过程中发生了基因的重复,且在结构上出现了分化。根据MLX56基因家族的蛋白及结构特征,该基因家族可能属于具有凝集素活性的几丁质酶。MLX56基因在桑树不同种及不同组织中的表达存在差异,暗示这些基因在桑树不同种及不同组织中的功能存在一定差异。     

毛果杨基因组序列草图的构建与初步分析

本文报道黑三角叶杨(Populus trichocarpa Torr.& Gray),也即毛果杨全基因组序列测定及分析结果.采用鸟枪测序法并结合遗传作图最终获得该物种全基因组序列草图.本研究还鉴定出45 000多个蛋白质编码基因.分析结果进一步显示,该物种在杨柳科属种分化之前曾经历过一次全基因组复制事件,大约有8 000对经复制产生的重复基因至今依然保留在杨属基因组之中；至于年代更为久远的另一次复制事件则发生在杨属与拟南芥属种系分化之前.与拟南芥属相比,杨属植物在核苷酸取代,串联基因重复,以及染色体重排上似乎均显得较为缓慢.杨属基因组的蛋白质编码基因明显多于拟南芥属,每一个拟南芥基因平均约存在1.4至1.6个杨属同系物.不过,该两个基因组中蛋白质结构域的相对频率基本相同.此外,在杨属基因组中还发现大量与木质素纤维素壁生物合成,分生组织发育,抗性,以及代谢物转运相关的特异性基因.     

版纳龙竹CONSTANS同源基因的克隆与序列分析

以版纳龙竹基因组DNA为模板,采用前人基于水稻CO同源基因Hd1序列的保守区所设计的特异引物COS1和COA1,运用PCR方法扩增出一条1 520 bp的DNA片段,并克隆到pGEM-T载体。测序和序列分析结果显示:该片段含有1个590 bp的内含子,编码区930 bp共编码310个氨基酸;该基因被命名为DxCO1,其DNA序列在G enB ank中的注册号为GQ358925。在G enB ank中进行同源性检索的结果显示:其核苷酸序列与其它禾本科植物CO同源基因的氨基酸序列同源性高达81%~91%;推测的DxCO1蛋白质序列与其它种子植物CO同源基因蛋白质序列的系统发育分析结果显示:DxCO1与小麦Hd1-like等5个基因聚成了一个强烈支持的分支;另外,在该片段推测的蛋白质序列的氨基端含有一个类似锌指蛋白的B-box(Cx2Cx8Cx7Cx2Cx4Hx8H)结构域,羧基端含有一个CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。序列和结构的高度同源性表明:DxCO1是版纳龙竹的1个CO-like基因,可能对其开花调控有着重要作用。     

杨树ASE蛋白的生化功能研究

[目的]谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶(ASE)在植物嘌呤合成中发挥着关键作用,本研究的目的是详细揭示杨树ASE蛋白的生化功能特性。[方法]通过半定量RT-PCR、蛋白质亚细胞定位以及测定纯化蛋白的催化活性等方法来研究其在体外的生化功能,进一步通过互补拟南芥缺失突变体(atase2)来研究杨树ASE基因的体内生物学功能。[结果]从杨树基因组中鉴别出2个ASE基因,序列分析发现它们之间有很高的蛋白质序列相似性。半定量RT-PCR分析发现两个杨树ASE基因在根、茎、叶和芽中均表达。蛋白质亚细胞定位分析发现杨树ASE蛋白均定位在叶绿体中,而且两个杨树ASE蛋白均能完全互补拟南芥atase2突变体的表型。酶学性质分析表明,杨树两个ASE蛋白均能催化5-磷酸核糖-α-焦磷酸生成5-磷酸核糖-β-胺。[结论]本研究预示着两个杨树ASE蛋白在嘌呤合成中均发挥着重要作用。     

油茶总RNA的提取与内参基因的初选

为得到高质量的油茶总RNA及稳定的内参基因,以油茶良种‘华硕’为试验材料,采用ambion试剂盒结合CTAB法进行总RNA提取。获得的总RNA完整性好,纯度高;从前期构建的油茶转录组数据中选取ACT(肌动蛋白基因)等14个基因作为候选内参基因,共设计22对引物,通过RT-PCR反应体系的优化及琼脂糖凝胶电泳检测,快速筛选出了适合油茶不同组织(器官)的内参基因。ALB(清蛋白基因),EF1α(延伸因子基因),ETIF3H(启动因子基因),UBC2(泛素结合酶基因)可以作为油茶果实初选内参基因,EF1α可以作为油茶根、茎、花及果实内参基因,ETIF3H可以作为油茶根、茎、叶、花瓣的内参基因。     

毛果杨赤霉素氧化酶基因家族鉴定与功能分析

【目的】赤霉素氧化酶(GAox)是不同赤霉素之间相互转化的关键酶,属于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因家族(2ODD),选择毛果杨GAox基因家族为研究对象,探究木本植物GAox基因家族成员的进化关系和功能分化机制。【方法】在Phytozome和PLAZA数据库中搜索到水稻、拟南芥和毛果杨2ODD基因,通过系统进化分析确认毛果杨2ODD基因中参与赤霉素代谢的GAox基因,然后整合基因组定位、基因结构、基因表达模式和酶生化活性等数据对GAox基因家族进行研究。【结果】从毛果杨基因组中鉴定得到124个2ODD成员,通过系统进化分析确认其中包含27个GAox基因,它们可能参与到赤霉素合成。毛果杨27个GAox基因分成4个亚家族,分别是C20-GA2ox、GA20ox、C19-GA2ox和GA3ox。基因组定位的结果发现27个毛果杨GAox基因分散定位在19条染色体中的14条染色体上,其中有11对GAoxs基因是由基因组的大片段重复产生的。酶学活性测定的结果表明,PtGA2ox3和PtGA2ox5催化GA1生成GA8,GA9生成GA51,而PtGA20ox6、PtGA20ox7和PtGA20ox8催化GA15生成GA24,GA24生成GA9,GA53生成GA20,显示该基因家族成员在底物特异性方面发生了变化。其中PtGA2ox3对GA9的活性是PtGA2ox5的104倍,但是PtGA2ox3和PtGA2ox5具有相似的三维结构。通过活性中心的序列比对发现,PtGA2ox3存在多个非极性氨基酸,PtGA2ox5存在多个带羟基的氨基酸,推测Pt GA2ox3活性中心位置附近的非极性基团是引起其催化活性高的原因。【结论】毛果杨GAox基因家族的基本特征、进化关系和部分基因的功能得到了初步解析,为加深对毛果杨赤霉素代谢途径的了解提供新的视角。     

基因组水平上杨树NAC基因家族的初步分析

利用其他物种的NAC蛋白,构建NAC结构域的位置特异得分矩阵(PSSM).用PSSM搜索整个杨树Populus L.基因组,获得编码杨树NAC结构域的DNA片段在基因组上的位置信息.然后运用Perl脚本语言从基因组相应位置提取包含基因全长的序列,推测NAC基因的全长、氨基酸序列及其结构特征,并对得到的杨树NAC基因家族进行了系谱发生分析.结果表明:杨树中至少存在132个非冗余的NAC基因,系谱分析表明这些NAC基因归属于14个亚家族,同一亚家族内各基因编码NAC结构域的外显子数量和结合位置的分布具有一定的相似性.     

毛果杨PLD基因家族全基因组水平鉴定及其盐胁迫下的表达分析

[目的]对木本模式植物毛果杨PLD基因家族的进化中的选择压力、启动子中顺式作用元件、组织表达特性以及盐胁迫下表达模式进行分析,为挖掘PtrPLD在非生物胁迫中作用提供参考.[方法]利用拟南芥PLD基因家族蛋白序列比对得到毛果杨基因组同源基因,再经过保守结构域鉴定后确定PtrPLD基因;利用软件ClustalW和MEGA...     

油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析

酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995.     

油茶转录因子基因CoSOC1-like的克隆和表达分析

[目的]克隆油茶的SOC1同源基因(CoSOC1-like),分析其序列特征和表达模式及其蛋白进化.[方法]以3年生油茶嫩叶为材料提取RNA,利用RT-PCR和RACE方法克隆油茶的CoSOC1-like基因,用生物信息学工具分析其序列特征,用荧光定量PCR分析其表达模式,用基因瞬时表达法分析其蛋白的亚细胞定位.[结果...     

叶绿体全基因组序列确定钻天柳在杨柳科中的系统发育位置

[目的]为解决濒危物种钻天柳在杨柳科中分类学位置的争议。[方法]本研究通过二代测序技术,从头测序、拼接得到钻天柳叶绿体基因组全序列,并与已发表的9种杨属植物和4种柳属植物的叶绿体基因组全序列进行比较,采用最大似然法、最大简约法和贝叶斯推断法分析了这些物种的系统发育关系。[结果]研究发现:钻天柳总基因组为155 661 bp,由长度为84 536 bp的长单拷贝(LSC)区域和16 215 bp的短单拷贝(SSC)区域,以及一对分隔开它们的27 455 bp的反向重复序列(IRS)组成。钻天柳叶绿体基因组总GC含量为36.68%,共有113个不同的基因,包括79个蛋白质编码基因,30个tRNA基因和4个rRNA基因,其中,有20个基因分布于反向重复区;在所有基因中,有14个基因包含1个内含子,3个基因(rps12、clpP、ycf3)内含有2个内含子;系统发育分析以100%的支持率将钻天柳与柳属黄花柳亚属的2个物种聚为一支,杨属的所有物种聚为另一支。[结论]本研究首次组装并注释了钻天柳叶绿体基因组全序列,并明确支持钻天柳并入柳属,而非单独成属,这将为钻天柳甚至杨柳科的系统进化研究提供重要参考。     

冷胁迫下普通油茶CCCH型锌指蛋白基因家族的鉴定和分析

【目的】为挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera遗传资源提供参考。【方法】基于普通油茶的冷胁迫转录组数据,对其CCCH型锌指蛋白基因进行鉴定,并对CCCH型锌指蛋白进行理化性质分析、系统发育分析、保守结构域预测、二级结构预测等相关生物信息学分析,并以庐山高海拔油茶(LSG)和栽培油茶品种赣无1(GW1)为材料,对CCCH型锌指蛋白基因在冷胁迫下的表达情况进行分析。【结果】在普通油茶的冷胁迫转录组数据中共鉴定到24个CCCH型锌指蛋白基因,参考水稻分类方法,将24个CCCH型锌指蛋白聚类到2个亚家族中。保守基序分析结果表明,在24个基因中仅有3种CCCH型锌指蛋白基序类型,即C-X8-C-X5-CX3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H,数目分别为92、4和4。转录组表达谱分析结果表明：在野外冷胁迫试验中CoC3H17基因在D4、D5和D6时期的表达量高于D1、D2和D3时期,在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶和赣无1的CoC3H17基因一直表现为更高的转录本丰度;CoC3H14和CoC3H24基因在野外试验的D4、D5和D6时期均表现...