鸡大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制

将菌毛化的大肠杆菌C600（fim^ ）经0.3%甲醛灭活后作为免疫原，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得1F4－1和2C32株抗F1菌毛a或b因子抗原单抗和1株抗F1c因子抗原单抗，它们均为IgG1。免疫印迹试验结果表明：3株单抗均能同禽大肠杆菌1型菌毛反应，识别分子质量为17ku左右的菌毛蛋白。同时对沙门氏菌及猪源大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应性，说明禽病原性大肠杆菌F1菌毛与沙门氏菌1型菌毛及猪大肠杆菌粘附素之间存在很大差异。     

鸡大肠杆菌(O78)1型菌毛单克隆抗体研制及对分离菌株的检测

将菌毛化的鸡大肠杆菌国内分离株GL7(O78)灭活后作为免疫原,经淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,获得3E1、3H1、4A9和5G4共4株能稳定分泌1型菌毛抗体的杂交瘤细胞,它们均为IgG。免疫印迹试验结果表明:4株单抗均能同鸡大肠杆菌1型菌毛反应,识别分子质量为17~17.5 ku的菌毛蛋白。同时对鸡大肠杆菌表达1型菌毛的分离株进行检测,结果表明同一血清型或不同血清型间的鸡病原性大肠杆菌1型菌毛之间存在差异,O血清型不能完全体现菌株间的遗传相关性。     

鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗的免疫原性

将由DNA-Star软件分析得到的具有1型菌毛抗原差异性的鸡大肠杆菌M10(O11)、GX7(O78)及YR10(O18)株,分别经营养肉汤37℃、48 h大容量培养后,提取O18菌毛制成单价1型菌毛油乳剂亚单位疫苗,制备O18全菌灭活疫苗及O11、O78、O18多价灭活疫苗。将4周龄SPF鸡分别免疫接种O18菌毛油乳剂疫苗(每雏菌毛免疫量200μg)和O18菌毛菌体灭活疫苗,均隔离饲养至7周龄,进行后胸气囊攻毒。结果表明,未免疫鸡的死亡率为66.67%~88.88%;免疫鸡用同源菌株攻毒死亡率为0;用异源菌株YR17(O2)攻击后死亡率为6.25%~41.17%。另有SPF鸡免疫O11-O78-O18多价菌毛菌体灭活油乳剂疫苗,隔离饲养至7周龄同法攻击,结果显示,免疫鸡用同源混合菌株攻击的死亡率为13.33%,未免疫攻击的死亡率为70.00%;免疫鸡用异源菌株O2攻击的死亡率为3.33%,未免疫鸡为61.53%。表明多价菌毛1型灭活疫苗不仅具有良好的免疫原性,而且具有一定的交叉保护作用。     

鸡大肠杆菌重组1型菌毛疫苗的免疫原性

[目的]制备鸡大肠杆菌重组1型菌毛疫苗,并探索其免疫原性。[方法]从含1型菌毛的基因重组菌株CZYRl0与野生型鸡大肠杆菌分离株YR（018）中提取1型菌毛,制备菌毛油乳剂疫苗。通过对鸡群的攻毒试验,探讨该疫苗的免疫原性。[结果]重组1型菌毛蛋白具有免疫保护作用。重组1型菌毛疫苗的保护力比分离的鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗保护率低,但差异不显著（P〉0．05）。[结论]该研究可为鸡大肠杆菌病的免疫防治提供依据。     

鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)克隆

根据人源大肠杆菌１型菌毛结构基因ＤＮＡ序列,在其保守区设计了１对带有ＢａｍＨ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ酶切位点的引物,经ＰＣＲ扩增,从２４株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到２１个大小约６５７ｂｐ的阳性产物,经酶切、连接、转化及筛选,得到３种来自不同自清型鸡源大肠杆菌ＰＣＲ产物的阳性克隆。经核酸序列测定,确认所克隆的外源基因为１型菌毛ｐｉｌＡ基因。     

张家口市禽源性致病性大肠杆菌耐药性的调查研究

应用Kirby-bauer法对临床分离的张家口市38株禽源性大肠杆菌进行药物敏感性试验，根据药敏结果判定耐药性。结果表明：分离菌对安苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素G、强力霉素、红霉素、氟哌酸、土霉素呈现较高的耐药性，其耐药率分别高达93．7％－71．2％；对庆大霉素、氯霉素、环丙沙星呈现中度的耐药性，其耐药率分别为50％－－37．1％；但所试菌株对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那、先锋VI，先锋V等耐药性较低，其耐药率仅为13．2％－－5．2％。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

抗GST单克隆抗体的制备及应用

用纯化的重组GST(谷胱甘肽S-转移酶)蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得4B3和1H10共2株能稳定传代并分泌抗GST单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,抗体类型均为IgG1,κ链,经Western-blot分析表明,2株单抗与GST-IBV-S1-F融合蛋白及重组GST蛋白均具有特异性反应,验证这2株单抗可用于检测GST融合蛋白的表达情况;用1H10单抗制备的亲和凝胶柱可用于GST融合蛋白的纯化.     

一例仔猪黄痢病原鉴定及防治试验

随着集约化养猪业的发展,致病性大肠杆菌对养猪业所造成的损失已日益严重,由致病性大肠杆菌引起的仔猪黄痢是目前规模化猪场影响仔猪存活率的严重制约因素。仔猪黄痢常发生出生后1周以内的仔猪。症状以拉黄色稀粪和急性死亡为特征,发病快,病程短,有高的发病率和死亡率。近年来,河南许多猪场一直有本病的发生,2008年我们实验室对怀疑发生仔猪黄痢的病猪,采集病料,进行病原分离鉴定和防治试验,现将结果报告如下。     

水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas campestris pv.oryzicola)单克隆抗体的研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术,融合经水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas campestris pv.oryzicola)免疫的BALB/C小鼠脾细胞和Sp2/O骨髓瘤细胞,经细条病菌典型菌株R17,R25和GX-1单独及三者混合包被进行ELISA检测筛选,建立了能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株18G 9,19D8,21F2,21G3,25E6和26F9细胞株。体外连续传代培养三个月,液氮冻存四个月后复苏培养,分泌抗体稳定。六株杂交瘤细胞的腹水单克隆抗体ELISA效价在1:2000左右。各株细胞的培养上清液ELISA效价为1:8左右。18G9,19D8和25E6细胞株所分泌的抗体为小鼠IgM类,21F2和21G3分泌的抗体为小鼠IgG_3亚类,26F9分泌的抗体为小鼠IgG_(2b)亚类。根据与植物病原细菌4个属6个种的20个不同菌株的特异性反应,将六株单克隆抗体分为A,B,C三组,20个菌株分为3个血清型和1个菌株群。     

仔猪大肠杆菌纤毛抗原反向间接血凝检测方法的建立与应用

为建立大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断和定量检测方法,用纯化的大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原免疫家兔制备阳性血清,其琼扩效价分别达到1∶32、1∶32、1∶128;利用该阳性血清IgG致敏醛化的绵羊红细胞,确定了最适K88、K99、987P阳性血清IgG的质量浓度分别为40、160、80μg/mL。用该方法对同一批次的K88、K99和987P纤毛抗原进行3次检测,K88、K99和987P纤毛样品的RIHA效价均为1∶1 600、1∶1 600和1∶800。结果表明,该检测方法具有较好的特异性和可重复性,可用于大肠杆菌K88、K99、987P纤毛抗原的快速鉴别诊断。     

抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备与应用

将鸡传染性支气管炎病毒M41 株尿囊液差速离心纯化 ,制备抗原 ;应用杂交瘤技术建立了 3株分泌抗鸡传染性支气管炎病毒的杂交瘤细胞株 ,其免疫球蛋白亚类分别属于IgG1 、IgG2a、IgG2b。 3株单克隆抗体与鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、产蛋下降综合征病毒及禽流感病毒均无交叉反应 ,YNZ - 55和YNZ - 62可识别多数鸡传染性支气管炎标准毒株及地方分离株 ,其腹水ELISA效价达 1 0 - 5,且识别的抗原位点互不重叠 ,为高亲和力的群特异性单克隆抗体 ,是制备鸡传染性支气管炎快速诊断产品的理想试剂     

猪大肠杆菌绵阳分离株灭活疫苗的制备及对小鼠的免疫原性研究

以猪致病性大肠杆菌绵阳分离株为菌种,制备油剂灭活苗、蜂胶灭活苗和铝胶灭活苗免疫小鼠,采用微量凝集试验对小鼠特异性抗体进行检测,并对抗体消长规律进行比较研究.结果表明,不同佐剂灭活苗在接种后一定时间内,都能刺激小鼠产生特异性抗体,但抗体产生的速度和免疫力持续时间有着明显差异.油佐剂苗产生抗体的速度较慢,第7天时检测到少量抗体,免疫持续时间长,第56天仍维持在较高的水平;蜂胶苗具有产生抗体速度快、持续时间长的优点,第3天即有抗体产生,第56天维持在较高水平;铝胶苗产生抗体速度较慢,第7天检测到少量抗体,第56天产生的抗体较油苗和蜂胶苗低1个滴度.对3种佐剂灭活苗免疫原性的综合评价认为,蜂胶苗最好,油苗其次,铝胶苗最差.     

襄樊市肉食品大肠杆菌污染状况的检测

采用国家标准法对抽样的肉类食品进行大肠杆菌的检测鉴定,结果表明：从襄樊市的几个大型农贸市场随机抽检的60个样品中,生鸡肉大肠杆菌检出率为30%,生猪肉50%,生牛肉20%,熟肉类20%。襄樊市肉类食品总体上大肠杆菌污染程度较轻,但猪肉类检出率较高,需引起有关部门的重视,特别是夏季,要加强监督检测,以防止出现大规模的食物中毒事件。