肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

猪源性成分的PCR检测技术优化研究

为确定食品和饲料中的猪源性成分,本试验优化了PCR检测猪源性成分的反应体系.试验采用20 μl的PCR反应体系,分别测定Taq DNA聚合酶为0 U、1 U、2 U、3 U时;25 m mol/L的MgCl2为0、2、4、6μl时;dNTP为0、0.1、0.2、0.4μl时,其他PCR反应因素为最大量的结果.结果表明:优化的猪源性成分PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、dNTP适宜浓度分别为2 U,2μl,0.4μl.优化后的反应体系对猪肉DNA最低检测浓度为0.04ng/μl.本研究优化出的猪源性成分PCR反应体系经二重PCR反应技术进行验证,不仅快速,简便,准确性与灵敏度高,并且经济、高效.     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化.结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕...     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

建立了驴源性成分的快速分子检测方法,确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR,扩增目的片段的长度是294 bp,经验证引物对驴源性成分的特异性良好,确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认,所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测,检测结果准确。     

应用两种PCR方法检测饲料中牛、羊源性成分

对普通PCR和实时(realtime)PCR两种方法在饲料中牛、羊源性成分检测中的应用进行了比较。分别设计并合成相应的引物和探针,对饲料中的牛、羊源性成分进行检测。结果表明,用普通PCR最低可以从饲料中检出0.1%的牛、羊源性成分,realtime PCR最低可以从饲料中检出0.01%的牛、羊源性成分。     

饲料中羊源组织成分的PCR检测

应用Chelex-100快速提取动物基因组DNA的方法,并根据羊线粒体基因的核苷酸序列设计1对引物,通过对分离的DNA进行PCR扩增、基因克隆及核苷酸序列分析,实现了对动物源性饲料中羊组织成分的检测.结果显示,该方法对羊组织DNA检测的敏感性可达20.16 pg/μL,当肉骨粉样品中含有质量分数为0.050%的羊源性成分时仍能检出,整个过程约需3 h.     

广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中牛羊源性成分监测

为了监测广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中的牛羊源性成分,掌握动物饲料安全情况,农业部饲料质量监督检验测试中心（南宁）于2005～2009年,应用实时荧光PCR和PCR对广西南宁、柳州、防城港、北海、钦州、桂林等市974批反刍动物饲料及动物源性饲料产品进行牛羊源性成分的抽样检测。结果表明,2005～2006年共有12批产品被检出含有牛羊源性成分,其涉及所有抽检产品类别和饲料生产、经营、使用3个环节;2007—2009年的抽检合格率均达100％。说明广西的反刍动物饲料和动物源性饲料的牛羊源性成分呈现下降趋势,反刍动物饲料逐步转向安全生产及使用的方向发展。     

食品和饲料中猫源性成分实时荧光PCR检测方法

采用实时荧光PCR方法对食品和饲料中猫源性成分进行TaqMan探针检测.结果表明:该检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点,在动物和植物材料基质中,均能检出0.01％的猫源性成分,适用于市售食品和饲料中猫源性成分的检测.     

Development and Application of a PCR Approach for Detection of Bovis, Sheep, Pig, and Chicken Derived Materials in Feedstuff

A PCR method for detection of bovis, sheep, pig, and chicken derived materials in feedstuff was established, and the existing method was improved according to the research on general primer and species-specific primers. First, general primer designed according to 16S rRNA gene sequence of hovis, sheep, pig, chicken, fish, and horse mtDNA was used for primary detection of animal derived materials in feedstuff. Species-specific primers designed according to conserved sequence of mtDNA of bovis, sheep, pig, and chicken were used for amplification of a 271,274, 149, and 266 bp fragment, respectively. Further confirmation of the detection result was then carried out. PCR method for detection of animal derived materials in unknown feedstuff was developed by using general primer, relevant PCR system, and PCR condition. Also a PCR method for detection of each species （bovines, sheep, pig, and chicken） was designed by using our speciesspecific primers. High sensitivity and specificity of our method were confirmed with a minimum detection level of 0.1%. Method for detection of animal derived materials in this research is not only cheap and easy for operation but also precise and reliable results can be obtained. It could be one of the effective methods for the detection of animal derived materials in feedstuff.     

PCR检测饲料中牛源组织成分的研究

为从动物饲料中快速检测所含牛源组织成分以有效防止疯牛病传入，根据牛线粒体基因核苷酸序列设计1对引物，应用CheleX法分离饲料中牛源组织成分的DNA．对分离的DNA进行PCR扩增、基因克隆及核苷酸序列分析，并建立饲料中牛源组织成分的PCR检测方法．用建立的PCR方法对羊、猪、鸡、兔和鱼组织基因组DNA进行扩增，均无特异条带；将牛组织基因组DNA倍比稀释，分别对各个稀释度的DNA进行PCR扩增，结果表明，该方法对牛组织DNA检测的敏感度可达25．2pg／μL．用该研究建立的方法对含不同量牛肉粉的鱼粉进行检测，其最小检测量达0．05％（质量分数），整个过程约需3h．     

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为快速检测出食用肉类中掺假物质,确保消费者切身利益,维持正常市场秩序,提升贵州省产品质量监督检验的检测能力,采用实时荧光定量PCR对猪源性成分和牛源性成分进行检测.结果表明:荧光PCR可以用来检测猪、牛等动物源性成分,且检测灵敏度为1％;荧光PCR检测动物源性成分提高了检测效率及灵敏度,降低了假阳性机率.     

牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用

本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。     

羊附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据羊附红细胞体16S rRNA基因序列设计特异性引物,建立了羊附红细胞体的PCR诊断方法.该方法能扩增羊附红细胞体16S rRNA基因片段,对大肠杆菌、羊无形体、羊源支原体、猪附红体和假单孢菌基因组DNA没有扩增出条带,所能检测羊附红细胞体DNA的最低量为1.82 pg/mL.运用所建立的方法对从重庆市荣昌县采集的110份羊血样进行附红细胞体检测,其中13份羊附红体感染阳性,表明该方法特异性和灵敏度高,可用于急性羊附红细胞体病和临床带菌羊的检测.     

牛环形泰勒虫巢式PCR诊断方法的建立

根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列设计2对巢式引物,成功建立了环形泰勒虫病的巢式PCR快速检测方法.验证试验结果表明,PCR扩增产物测序结果与GenBank收录的Tams1序列同源性在92%～99%,对环形泰勒虫检测具有良好的特异性、重复性以及灵敏度.对新疆焦虫病疫区牛群血样检测发现,巢式PCR检出率为62.2%(61/98),高于常规PCR检出率(58.2%,57/98)和血涂片镜检检出率(35.7%,35/98),提示该巢式PCR方法可用于大规模的环形泰勒虫病的流行病学调查.     

Chelex-100快速提取动物源饲料DNA方法的建立

为防止疯牛病疫区反刍动物源性饲料传入我国,非常有必要对贸易往来中的肉骨粉品种来源进行鉴定。本文建立了一种利用Chelex—100快速提取动物源性饲料DNA的方法,用于反刍动物源性饲料的PCR扩增分析。结果显示该方法与GuSCN法、SDS法同样理想,从而实现了对进境饲料的快速检定的要求。该方法检测灵敏度达到牛成分含量为0．1％的水平,具有简单、快捷、灵敏度高的优点。