上西早生柿ETR5基因片段的克隆与植物表达载体的构建

从上西早生(Uenishiwase)柿叶片中,提取了基因组DNA。以基因组DNA为模板,经PCR扩增,克隆到一个549 bp的ETR5的DNA片段。序列分析表明,上西早生柿基因与洋梨ETR5的核苷酸同源性为79.0%,氨基酸同源性为81.0%;并且含有其他植物ETR5的保守氨基酸区和不变氨基酸残基,表明克隆到的序列是上西早生柿ETR5的基因片段。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,连接到植物表达载体pBI221上,构建成Uenishiwase-ETR5基因的植物表达载体。     

东北雅罗鱼微卫星分子标记的筛选及特征分析

通过磁珠富集法筛选东北雅罗鱼的微卫星分子标记.采用限制性内切酶Sau 3AI对东北雅罗鱼基因组DNA进行酶切,选取400～900 bp的片段进行PCR全基因组扩增,并利用生物素标记的(CAG)8、(TGA)8、(AGAT)6、(GATT)6 4个探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中...     

长江下游铜鱼线粒体DNA（mtDNA）遗传多样性的PCR-RFLP分析

对长江下游铜鱼线粒体DNA控制区（D-Loop区）和细胞色素b（Cytb）基因进行PCR扩增,扩增片段用10种限制性内切酶酶切。PCR-RFLP研究结果表明,D-Loop区和Cytb基因均未表现出个体之间的长度变异现象。10种核酸内切限制酶中,有2种对Cytb基因有酶切位点,有3种对D-Loop区有酶切位点。有酶切位点的5种限制性内切酶共检测到3种线粒体DNA单倍型。在Cytb基因检测到铜鱼个体间的变异,在D-Loop区没有检测到铜鱼个体间的变异。长江下游铜鱼线粒体DNA单倍型多样性指数（h）为0.6071,线粒体DNA遗传多样性较低。     

莲雾乙烯受体基因保守序列的克隆及分析

用莲雾的叶片提取基因组DNA作为模板,根据乙烯受体基因的保守序列设计引物,进行PCR扩增,得到长度约1.5kb的目的片段,将其克隆到pGEM T-easy载体转化大肠杆菌,提取质粒,进行限制性内切酶图谱分析及序列测定.结果表明,该目的片段全长为1400bp,与栽培稻(Oryza satzva)的osers基因组DNA可比对序列的一致性为98.68%.在所应用的12个内切酶中,该片段内部没有切点,根据序列特征和与其他乙烯受体基因序列比较,推测该片段有2个内含子和3个外显子片段组成,外显子总长为972 bp,编码324个氨基酸,其中第197～324氨基酸残基与组氨酸蛋白激酶的磷酸基团接受域有同源性.     

毛蚶、魁蚶和泥蚶核糖体DNA转录间隔区的RFLP分析

对毛蚶、魁蚶和泥蚶核糖体DNA转录间隔区(ITS区)进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析发现,6种限制性内切酶(HaeⅢ,HhaⅠ,HpaⅡ,RsaⅠ,Sse9Ⅰ和TaqⅠ)均能将泥蚶与毛蚶及魁蚶区别开来,但未发现毛蚶和魁蚶间特异性的RFLP标记.对酶切图谱进行的数理分析结果显示,毛蚶与魁蚶之间的净遗传距离Pnet值为0,而泥蚶与毛蚶、泥蚶与魁蚶之间的Pnet值均为0.079 7;泥蚶群体内检测到5种酶切复合单倍型,核苷酸多样性指数π值为0.000 8外,而毛蚶和魁蚶群体内为相同的1种复合单倍型,π值均为0.     

基于改进的Southern杂交法检测古树木端粒长度的研究

研究旨在利用DNA印迹法测量端粒长度从而预测植物的年龄,但木本植物体内富含黄酮类、酚类、多糖、萜类等次生代谢物质,严重影响了提取的基因组DNA产量和质量,以及后续的酶切及杂交实验结果。笔者以北京颐和园5种古树为实验材料,在传统CTAB法提取DNA基础上,不同树种分别添加2%~6%PVP,可有效去除次生代谢物质对DNA的干扰,可被限制性内切酶HinfⅠ酶切完全。同时,对DNA印迹法的其他实验参数如DNA量、曝光时间进行了优化,并进行了3种不同年龄古树端粒长度测定,结果显示古树的平均端粒长度要高于幼树,本研究建立的实验方法为多年生林木特别是古树端粒长度、树龄检测与寿命预测等提供了参考。     

棉铃虫不同地理种群间基因流动的RFLP分析

RFLP标记是一种灵敏而有效的分子标记,它可利用昆虫遗传多态性推断昆虫因迁飞导致不同地理种群基因流动的事件。在比较实夜蛾亚科昆虫多巴脱羧酶(DDC)基因的基础上,根据同源序列,设计了2对引物,利用PCR扩增获得了一条730bp的特异性片段,以此作为探针。将棉铃虫的核DNA用EcoRI完全酶切后,用该探针进行Southern杂交,在分子水平上检测了棉铃虫种群的核DNA的限制性片段长度多态性(RFLP)。对杂交后的RFLP带型进行遗传分析表明,辽宁种群不仅和黄河流域种群有相同带型的个体,而且部分个体与长江流域也有相同的带型,显示了辽宁种群与黄河流域和长江流域的种群都有基因交流。     

一种新的快速鉴定蛋白与靶DNA结合位点的方法

DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用, 对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA, 采用序列胶分离DNase I酶切片段, 操作较复杂, 分辨率较低, 不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制, 本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I Foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 选用荧光色素代替同位素标记, 毛细管电泳技术代替序列胶检测DNase I酶切片段, 判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时, 在判定的GmMYB1结合区域的基础上, 选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验, 证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠, 作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。     

大豆品种间DNA限制性片段长度多态性（RFLP）的分析

用６２个大豆ＤＮＡ分子探针与５种限制性内切酶组合，对大豆基因组ＤＮＡ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）进行分析，结果表明，所选用的两对材料，其多态性ＲＦＬＰ标记的频率均高达６０％，可作为ＲＦＬＰ作图较理想的亲本，ＲＦＬＰ标记的多态性类型表现为共显性，少数为显性，其中一些标记揭示了２个或２个以上的独立分离的基因座位，不同限制性内切酶的揭示多态性的能力上差异不显著，在杂交片段长度上差异显著并都大于预期，     

不同饲养条件下内蒙古绒山羊瘤胃甲烷菌组成的研究

为了解天然放牧和舍饲条件下内蒙古绒山羊瘤胃中甲烷菌的种群组成.选取甲烷菌mcrA基因的特异性引物序列,利用PCR技术对从瘤胃液中抽提的细菌总DNA进行扩增,并建立了甲烷菌特异性的mcrA基因文库.用限制性内切酶Taq I对该文库特异性片段进行了限制性酶切片断长度多态性分析(Restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP).放牧和舍饲内蒙古绒山羊瘤胃中甲烷菌的mcrA基因片段被分成6个不同的RFLP类型,并由此建立了DNA指纹图谱;系统发育树分析表明,其属于甲烷杆菌目和甲烷微菌目,且绒山羊瘤胃中的甲烷菌大部分属于甲烷短杆菌.放牧绒山羊瘤胃内甲烷菌种类比舍饲绒山羊更加丰富,6种甲烷菌所占比例均较高,而舍饲绒山羊只有两种优势菌比例较高,其他几种所占比例极低.     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

荧光素酶表达载体yy621的构建及鉴定

在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加BglⅡ限制性内切酶位点,构建yy621载体。用PCR的方法分别扩增CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因。引物设计要满足如下条件:CaMV 35S minimal启动子序列扩增片段的上游应包括Bam HⅠ、下游应包括BglⅡ限制性内切酶位点;LUC基因序列扩增片段的上游应包括BglⅡ、下游应包括XbaⅠ限制性内切酶位点。以上两个片段先用BglⅡ限制性内切酶消化后进行连接,得到CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间含BglⅡ限制性内切酶的识别位点的片段,然后再用Bam HⅠ和XbaⅠ限制性内切酶进行消化,插入到载体yy449的Bam HⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,替换原有的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列。经菌落筛选、PCR鉴定和测序验证,阳性菌落中的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间包含BglⅡ限制性内切酶的识别位点,载体yy621构建成功。本实验中构建的荧光素酶表达载体yy621,适于今后用抗性相关基因替换LUC基因,测定合成启动子对抗性相关基因的具体调控与赋予植物对不良环境的具体抗性表现,或者用全长启动子序列替换CaMV 35S minimal启动子序列(-46～+1),对进一步观察LUC基因的表达调控具有重要的意义。     

遗传标记及其在园艺植物研究中的应用

评述了形态学标记（morphological markers）、细胞学标记(cytological markers)、生化标记(biochemical markers)、DNA分子标记(DNA molecular markers)等技术的发展现状,着重介绍了近年来DNA指纹图谱技术,即限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、随机扩增片段长度多态性 (Random Amplified Polymophismic DNA,RAPD)、简单重复序列 (simple sequence repeats,SSR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP) 等标记技术的特点及其在园艺植物品种的分类鉴定、纯度的分析检测及品种间亲缘关系等研究中的应用。     

RFLP分子标记及其在蔬菜研究中的应用

RFLP技术是一种高效的基因组DNA多态性分析技术,其原理是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,检测含同源序列的酶切片段在长度上的差异,具有可靠性较高,但操作烦琐、信息含量低等特点。本文综述了RFLP分子标记技术在蔬菜分类学及遗传多样性研究、遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助育种方面的应用情况,并对其应用前景进行了展望。     

乡村驿站

什么是DNA分子标记指纹图谱鉴定什么是DNA分子标记指纹图谱鉴定DNA分子标记指纹图谱鉴定是根据任何品种都具有该品种所特有的细胞遗传学的特征,利用分子标记技术,如限制性片段长度多态性(简称RFLP)、     

DNA分子标记及其在甘蔗育种上的应用

DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记，在甘蔗育种方面发挥了重要作用。DNA分子标记包括：限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)、染色体或基因组原位杂交(GISH)、荧光原位杂交(FISH)等。本文对植物DNA分子标记的原理、特点及其在甘蔗种属鉴定、遗传多样性分析、分子图谱构建及病害分子诊断等方面的研究进行简要的概述。     

玉米雄性不育性研究Ⅷ. 对玉米YⅡ-1不育胞质线粒体DNA RFLP分析

以玉米T、S、C群及新选育的YⅡ-1不育系为材料，用这4类群不育胞质线粒体DNA，经4种限制性内切酶酶切，长距凝胶分离酶切片段获得高分辨率的清晰谱带。再以5种线粒体特异的基因片段作为探针与酶切条带杂交，结果表明：T、S、C群表现较多差异的杂交带型，持有明显的多态性，YⅡ-1型杂交带与T、S群区别明显，与C群有少量差异。     

扁吻鱼微卫星分子标记的筛选及特征分析

通过磁珠富集法筛选扁吻鱼的微卫星分子标记。利用限制性内切酶Sau3AI对扁吻鱼的基因组DNA进行酶切,并选取片段大小在250～750 bp间的片段,利用PCR技术进行全基因组扩增,采用生物素标记的(CA)8探针对微卫星片段进行富集。富集后的片段与T载体连接后利用DH5α大肠杆菌进行转化,然后以Sau3AI为引物对菌落进行PCR扩增,扩增后选片段大小符合条件的菌落挑取至测序板,进行测序。结果表明:PCR筛选共获得563个阳性克隆,其中测序192个阳性克隆后发现有53个微卫星序列;序列分析表明,完美型占67.92%,非完美型为22.64%;混合性标记占9.43%。根据测序结果设计微卫星引物24对,经PCR扩增筛选,琼脂糖凝胶电泳结果显示,其中22对引物可扩增出清晰的条带,其中具有多态性的13对。利用13对多态性引物对扁吻鱼野生群体进行扩增,PCR扩增结果显示,等位基因数为3～6,多态信息含量(PIC)为0.625 3,12个位点处于高度多态水平(PIC>0.5)。     

棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析

 以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4     

不同水系中华绒螯蟹线粒体COⅠ基因片段的RFLP分析

应用PCR-RFLP技术分析了长江、瓯江和辽河3个水系中华绒螯蟹的线粒体COⅠ的基因片段遗传多样性,应用11种限制性内切酶对COⅠ基因片段进行限制性片段长度多态分析,共检测出6种复合单倍型,其中瓯江群体检测出5种复合单倍型,长江和辽河均有2种复合单倍型。经数理统计分析,3个群体内线粒体DNA的核苷酸多样性指数分别为0.006 7(长江)、0.016 7(瓯江)和0.000 3(辽河),瓯江群体的遗传多态度最高,其次为长江群体,而辽河群体在3个群体中遗传多态度最低。结果说明,中华绒螯蟹具有一定群体内遗传多样性:瓯江群体>长江群体>辽河群体。在群体间,辽河与瓯江群体的净遗传距离最大为0.023 7,长江与瓯江群体间的净遗传距离次之为0.020 7,而长江与辽河群体间的净遗传距离最小为0.004 3,说明3个种群中长江与瓯江种群间的亲缘关系最近,而辽河与瓯江种群间的亲缘关系最远。