变性高效液相色谱高通量检测动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌

应用复合PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,通过通用增菌培养,建立动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的快速高通量检测方法.根据沙门氏菌和志贺氏菌特异基因序列分别设计特异性引物,复合PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测.以49株参考菌株做特异性试验,并开展了精密度检测试验.试验结果表明,该方法具有很好的特异性和精密度,经通用增菌和复合PCR-DHPLC技术可同时检测饲料中的沙门氏菌和志贺氏菌.该方法可以快速、准确、高通量检测,是动物源性饲料中致病菌高通量检测的新技术.     

三种鸡源致病性细菌多重PCR检测方法的建立

为建立快速同步鉴别鸡源巴氏杆菌、大肠杆菌和沙门菌的多重PCR检测方法,参考GenBank中大肠杆菌Pho A基因序列、沙门菌inv A基因序列和巴氏杆菌kmt 1基因序列,设计了3对特异性引物。通过优化引物浓度及退火温度建立多重PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、鸡支原体及禽白血病等核酸扩增为阴性;对大肠杆菌、沙门菌和巴氏杆菌3种核酸最低检测量分别为12.5 pg/mL、15.0 pg/mL、50.0 pg/mL;多次重复性试验结果一致。结果表明,建立的多重PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,为鉴别诊断这3种致病细菌提供了快速、便捷的检测方法。     

食品与饲料中致病微生物检测技术及展望

致病微生物污染是造成饲料和食品质量安全风险的重要因素之一。本文着重就我国现行有效的饲料和食品中致病微生物检测标准所涉及的传统检测方法和现代快速检测技术进行了论述和归纳分类。按照检测方法的原理将现代快速分析技术分为免疫识别技术、核酸测定技术、核酸杂交技术和细胞成分分析技术四大类,同时提出了应用现代分析技术解决传统微生物鉴定技术问题的思考。随着科学技术的进步与发展,芯片生物传感器技术、MALDITOF-MS质谱分析技术和基因测序技术或将成为今后饲料和食品中致病微生物检测技术发展的方向。因此,迫切需要建立适应于现代新技术发展要求的国家细菌鉴定指纹质谱图数据库、分子分型数据库、基因序列图谱数据库,以便于新技术的研究与应用。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立与应用

参照GenBank公布的鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌fimH基因序列,根据两者在第37和第544位碱基的不同,设计了一对等位基因特异性引物,建立了一种鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR(AS-PCR)检测方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床样品进行了检测.结果表明,该AS-PCR的扩增产物大小为543 bp,核酸检出限为12.6 pg/μL,菌液检出限为2.3×104 cfu/mL,适用于鸡泄殖腔拭子、鲜蛋、饲料和饮水中鸡白痢沙门菌的检测.该AS-PCR检测方法具有简便、快速、特异性强、敏感度高等特点,可应用于鸡白痢沙门菌的快速检测.     

家禽免疫抑制病液相芯片检测方法的建立

本研究针对传染性法氏囊病毒、鸡传染性贫血病毒、J亚型禽白血病病毒、马立克病毒1型基因组、新城疫病毒、禽流感病毒的特异性核酸序列,分别设计了6种病毒的特异性引物、通用扩增引物,及荧光编码微球包被用特异性探针。借助全新的通用扩增技术实现6种病毒核酸同时扩增,再与高通量的液相芯片检测相结合,进而实现4 h内6种病毒的快速准确检测。该方法创新性地将液相芯片技术GMPLex引入到动物检疫行业,突破了DNA病毒、RNA病毒不能同时检测及一次PCR不能完成检测的瓶颈,实现了一管一次PCR反应同时检测6种病毒,缩短检验周期,节约检验成本。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物(1对内引物、1对外引物),进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料(dNTPs)、内外引物比例、Mg~(2+)浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体多重TaqMan荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种应用于宠物布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体的高通量、高灵敏、高特异的检测方法,根据各自保守序列合成了特异性引物及Taq Man探针,通过优化反应体系,建立了多重Taq Man荧光PCR检测方法,并利用该方法对2021年厦门市抽检的304份犬猫全血样品进行了检测。结果显示：该方法特异性好,可特异性扩增布鲁氏菌、弓形虫和巴尔通体阳性核酸,其他对照菌株核酸均无扩增信号;抗干扰性强,检测混合模板时,不同成分间无交叉干扰反应;灵敏度高,最低检出限均为3×10⁰ copies/μL;重复性好,批内及批间重复试验变异系数均小于2%。应用该方法在4 h内即可完成304份临床样品的快速检测,此次临床抽检样品中未检出布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体阳性核酸。该方法大大提高了检测效率,为多种动物布鲁氏菌、弓形虫及巴尔通体感染的早期诊断及筛查提供了技术支持。     

多重核酸检测技术在动物疫病诊断和食品安全监测领域的研究进展

核酸检测技术是目前动物疫病诊断和食品安全监测的重要手段。多重核酸检测技术可同时检测多种病原,具有通量高、损耗低的优势,在疫病诊断和食品安全监测等领域的应用越来越广泛。目前已研发出多种多重核酸检测技术,包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)多病原核酸检测技术、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)多病原核酸检测技术、生物芯片多病原核酸检测技术、高通量测序多病原核酸检测技术等。由于检测原理不同,不同方法之间的检测性能存在较大差异。本文通过概述基于PCR/RT-PCR、LAMP/RT-LAMP、生物芯片、高通量测序建立的多重核酸检测技术,全面分析其在动物疫病诊断和食品安全监测领域中的特点和具体应用策略,以期推进病原检测技术的创新和发展,为动物疫病诊断及食品安全监测提供技术支持。     

饲料中志贺氏菌的PCR快速检测方法的建立

为建立饲料中快速检测志贺氏菌的有效方法,本研究根据志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH)设计了一对引物,PCR扩增片段长度为386bp。通过对引物的特异性检测发现,4株志贺氏菌的PCR结果均为阳性,12株非志贺氏菌的检测结果均未扩增出特异性片段。PCR对志贺氏菌纯培养物的检测灵敏度达120cfu/ml,检测快速、便捷。该方法操作简单、检验周期短、特异性和灵敏度高,能够快速地实现对饲料中志贺氏菌的检测和监控。     

应用液态悬浮芯片技术建立17种大肠杆菌耐药基因多重快速检测方法

为建立一种快速、高通量的多重耐药基因检测方法,利用Luminex液态芯片平台,建立了可同时检测17种耐药基因的液态芯片检测方法。该方法对大肠杆菌常见的七大类抗菌药物所对应的17种耐药基因（blaSHV、blaCMY-1、Aph3-IIa-1、aac(6)-Ib-cr、aadA-1、cmlA-1、gyrA、mcr-1、NDM-1、parC、qnrS-1、sul-1、sul-2、sul-3、tetA、tetB、tetX）进行序列分析,随后依次对其设计多重PCR特异性引物,构建特异的阳性质粒作为阳性参比品进行液态芯片检测条件优化,从而进行多重耐药基因液态芯片检测方法的研发。结果显示：成功构建了17种耐药基因的阳性质粒,并建立了两套体系用于检测17种耐药基因。在特异性试验中,两套体系中的检测信号无干扰,具有较高的特异性数值;敏感性试验中,体系一的单一质粒最低检测量为102~104 copies/μL,混合质粒为103~105 copies/μL;体系二的单一质粒最低检测量为102~105 copies/μL,混合质粒为104~106 copies/μL;有效性试验中,液态芯片法与PCR检测结果的Kappa值多在0.60以上,具有高度一致性。结果表明,本研究建立的2套液态芯片检测体系具有高通量、高灵敏和高特异性的优点,可同时对17种耐药基因进行检测,能够达到快速检测的目的。     

液相芯片技术在动物疫病检测中的研究进展

液相芯片技术是整合了激光技术、流式细胞仪、数字信号处理和传统化学技术的一种新型生物分子检测技术,目前广泛应用于各种免疫分析和核酸检测中。液相芯片技术支持单重和多重分析,可在多种测定方法中对蛋白质和核酸靶标进行高通量检测,具有高通量、操作简单、适用范围广、重复性好、特异性高、所需样品量少、更灵敏稳定、成本低等优点,正逐渐代替传统检测和定量病原体的工具,如实时荧光定量PCR扩增检测系统（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等检测方法。动物传染病严重危害着养殖业健康发展,一些诸如高致病性禽流感的人畜共患病对人类健康造成了严重威胁。高效灵敏的诊断系统将有助于在传染病暴发期间筛选大量样本,防止感染扩散。液相芯片技术的发展为高通量检测和疾病的预防提供了新的平台。作者简要概述了液相芯片技术的原理和优点,重点阐述了液相芯片技术在检测动物疫病,包括猪病、禽病、兔病、犬病、啮齿类动物和其他动物疫病方面的研究进展。相信今后液相芯片技术会成为临床诊断、基础研究、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督、生物武器防范等领域的一项重要分析检测技术,该技术的发展将大大推动生命科学研究与进步。     

液相适配体芯片在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素,对食源性致病菌的快速和高通量检测是防止和诊断细菌性食物中毒的有效手段。液相芯片检测技术具有需样本量少、高通量等特点。经典液相芯片技术是以有机荧光染料编码的聚苯乙烯微球为载体,新型液相芯片技术是以物理学、光学等编码的基质为载体,通过制备不同配体功能化的载体,实现对同一液相环境中多种靶细菌的同时检测。适配体是一类相比蛋白类抗体特异性高、筛选获得快、化学稳定性强的核酸配体。论文针对核酸适配体分析鉴及以适配体为基础的新型液相芯片技术在食源性致病菌检测中的应用进行了综述。     

PCR法检测犬常见皮肤致病真菌的试验研究

利用PCR检测方法可对犬临床疑似真菌性皮肤病样本进行诊断。笔者选用真菌通用引物,对已知标准菌株及不同微生物进行特异性检测,并对其敏感性进行检测。采用该方法对临床30份疑似为真菌性皮肤病犬病料进行检测并克隆测序,同时对30份病料进行表型分析。结果表明,3种常见皮肤致病真菌(犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌)PCR扩增条带为310 bp;特异性检测结果,该方法检测其他微生物和犬体细胞均为阴性;采用该方法进行PCR检测真菌核酸检测限可以达到100 pg/m L。采用该方法对30份临床病料进行检测,检出12份阳性,经测序7份为犬小孢子菌,4份为石膏样小孢子菌,1份为须毛癣菌。采用传统培养法检测出阳性样本10份,其中6份为犬小孢子菌,4份为石膏样小孢子菌。通用PCR方法与传统培养法相比,检出率无显著差异。与传统的培养鉴定方法相比,PCR检测方法操作简便、特异性和敏感性比较理想,符合率较高,可用于临床犬皮肤真菌病检测和流行病学调查,并具有重要的公共卫生意义。     

液相芯片鉴别检测7种出血性大肠埃希菌血清型

为了建立一种同时检测O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145等7种血清型的出血性大肠埃希菌的高通量检测方法,通过筛选比对大肠埃希菌O157血清型的fbE基因,O26、O103和O111血清型的WZX基因,O45、O121和O145血清型的WZY基因,设计了针对各个血清型的特异性引物和探针。通过在所有的特异性引物5′端加入超级引物的策略,达到了通过一次PCR反应,同时多重扩增7个血清型的7个目标片段的效果。将加尾多重扩增与液相芯片高通量检测相结合,建立了同时检测7种血清型的出血性大肠埃希菌的液相芯片检测方法,并对方法检测体系及反应条件进行了优化。所建立的7种出血性大肠埃希菌液相芯片检测方法灵敏,其灵敏度与荧光PCR的灵敏度相差100倍。所建立的方法特异,单个血清型的探针与相应的PCR扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交,LQRR值介于17~63之间。7种血清型的混合探针与各个血清型菌株的PCR与扩增的阳性产物之间均有特异性的杂交,LQRR值介于11~23之间,与其他血清型出血性大肠埃希菌和非出血性大肠埃希菌均无交叉反应。试验结果表明,所建立的液相芯片检测大肠埃希菌O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145等7个血清型的检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点,可用于主要出血性大肠埃希菌的快速鉴别检测。     

牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎可视化基因芯片检测方法的建立

针对现有牛病病原检测方法指标单一,操作复杂的现状,拟建立一种可高效检测牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、口蹄疫、病毒性腹泻黏膜病、副流感、传染性鼻气管炎的基因芯片技术。根据已公布的各病原核酸序列,设计引物和探针。利用多重PCR方法扩增目的片段,扩增产物与探针特异性杂交,芯片反应显色后肉眼观察进行检测结果判定。优化反应条件、建立检测方法,同时对检测方法的灵敏度、可重复性、特异性、保存期等进行评价。结果显示,该基因芯片检测方法单一病原灵敏度检测可达1.0×10~(-6) ng/μL,混合病原灵敏度检测可达1.4×10~(-5) ng/μL;各病原间无交叉反应,检测健康牛血清、组织,牛流行性热病毒也均无响应;针对同一阳性质控品,芯片重复率达100%。保存期试验表明,芯片在2～8℃至少可保存6个月。检测30份临床样本,结果与标准方法结果一致。实验建立的方法具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点,可在3 h内完成同时对七种牛重要疫病的检测,在牛群疫病诊断、净化及流行病学调查等方面有良好的应用前景。     

液相芯片技术同时检测六种猪繁殖障碍病毒的方法研究

在GenBank中收集猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2基因、猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2序列、猪伪狂犬病毒(PRV)的gB基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的NSP2基因、猪瘟病毒(CSFV)的E2基因和乙型脑炎病毒(JEV)的M基因,利用Primer5.0等分子生物学软件对收集的序列分析比较,筛选出上述基因的特异保守序列并设计引物和探针,将设计好的探针与相应的微球偶联,优化条件,建立检测方法。结果表明:建立的检测PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的多重液相芯片技术具有较好的特异性、敏感性和稳定性,对PPV、PCV2、PRV、PRRSV、CSFV、JEV6种病毒核酸的最低检出量分别为8.50×10~2copies/μL、2.87×10~2copies/μL、2.07×10~2copies/μL、2.61×10~2copies/μL、2.34×10~2copies/μL、2.05×10~2copies/μL,与相应病毒PCR/RT-PCR检测方法相比,敏感性提高了100~1000倍;对临床388份样品同步进行荧光PCR与液相芯片检测,结果99.87%相符。本方法为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础。     

多重链接探针扩增技术的原理及应用

多重链接探针扩增技术是将核酸杂交和PCR链式扩增相结合的一项高通量检测技术。该技术特异性强、敏感性高,可以实现多达50个靶分子的同步检测。自2002年被报道以来,该技术取得了很大进展,目前已广泛用于遗传性疾病的基因检测、肿瘤预后及传染病高通量检测领域。本文就多重链接探针扩增技术的原理、优缺点及应用等进行了探讨。     

山羊4种腹泻病原菌多重PCR检测方法的建立

为建立检测引起山羊腹泻的4种主要病原菌的多重PCR方法,本研究针对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K99基因,沙门菌invA基因,志贺氏菌侵袭性质粒H(ipaH)基因和奇异变形杆菌ureR基因设计4对特异性引物,通过对反应条件优化,建立快速检测引起山羊腹泻的4种主要病原菌的多重PCR方法,并应用该方法检测山羊腹泻样品。结果显示该多重PCR方法对巴氏杆菌等其它6种细菌无扩增;其敏感性分别为ETEC103cfu/mL、沙门菌102 cfu/mL、奇异变形杆菌102 cfu/mL、志贺氏菌103 cfu/mL;经检测该方法稳定性也好。应用该多重PCR方法对21份山羊临床腹泻样品的检测结果与细菌分离鉴定结果一致,无漏检。本研究建立的多重PCR方法可实现从山羊粪便样品中同时检测4种腹泻病原菌,对山羊腹泻病原菌的快速检测提供了技术支持。     

志贺氏菌检测和分群实时荧光PCR方法的建立

为对志贺氏菌属细菌进行快速、准确检测和分群鉴定,根据志贺氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB基因,分别设计引物和探针,建立了鉴定志贺氏菌属以及福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺菌氏菌实时荧光PCR方法,同时将根据ompA基因设计的引物和探针作为内参照,并通过特异性试验和人工接种试验等对该方法进行验证。结果显示,该方法对17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌均出现100%的特异性;用增菌肉汤直接进行PCR检测,发现在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中的志贺氏菌检出限为1～3 cfu/25 g(mL),在原奶、生肉和奶粉中的检出限分别为≤8 cfu/25 mL、12 cfu/25 g和≤12 cfu/25 g;分离培养后再对可疑菌落进行实时荧光PCR鉴定,发现所有样品的检出限为1～3 cfu/25 g(mL),与传统培养法检出限一致。结果表明,该实时荧光PCR方法是一个快速、敏感、特异的检测方法,适合于志贺氏菌的常规检测分析。