7种药剂对食用玫瑰叶螨的室内毒力及田间防治效果评价

二斑叶螨(Tetrangchus urticae)和朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是危害食用玫瑰的2种重要害螨,但是目前缺少关于食用玫瑰叶螨防治的农药产品登记。为筛选防治二斑叶螨和朱砂叶螨2种害螨的高效安全药剂,分别采用浸叶法和玻片浸渍法测定7种药剂对2种叶螨卵和雌成螨的致毒作用,并开展田间试验评价4种药剂对食用玫瑰的安全性和对2种叶螨的防治效果。室内毒力试验表明,腈吡螨酯、阿维菌素和联苯肼酯对2种害螨均具有较好的毒性,对二斑叶螨成螨和朱砂叶螨成螨的LC₅₀分别为9.068～26.590、2.390～6.107 mg/L,对二斑叶螨卵和朱砂叶螨卵的LC₅₀分别为1.705～16.798、0.846～7.948 mg/L;螺螨酯则对2种叶螨卵具有极好的致毒作用,对二斑叶螨卵和朱砂叶螨卵的LC₅₀分别为2.622、1.674 mg/L。田间试验结果表明,腈吡螨酯、阿维菌素、螺螨酯和哒螨灵等4种药剂对3个品种的食用玫瑰生产安全、无药害,腈吡螨酯、阿维菌素和螺螨酯对食用玫瑰2种叶螨防治效果优于常用药...     

mlnB基因敲除对解淀粉芽孢杆菌W1杀螨活性的影响

【目的】研究拟通过构建W1菌株突变体及其杀螨抑菌活性检测以从分子水平探究并验证此菌株的杀螨机理,为二斑叶螨的防治提供一种新的微生物资源和防治策略,为后续开发利用更多微生物资源奠定基础,也为新型微生物杀螨剂的研发与应用提供理论基础。【方法】前期对解淀粉芽孢杆菌W1的次级代谢产物的活性化合物进行研究,已确定其对二斑叶螨的杀虫活性物质为二酮哌嗪类,大环内酯类及巨杆菌素类等化合物。大环内酯类化合物中以大环内酯A为主要杀螨活性物质,而大环内酯A是由mln基因簇调控合成。通过构建敲除整合载体pBS-mlnB-kan^R转化导入W1菌株自然感受态细胞等操作,获得了其杀螨活性化合物——大环内酯生物合成缺陷突变体W1△mlnB::kan^R,利用PCR扩增及产物测序和HPLC-MS/MS技术证实敲除突变体的成功构建,并检测其杀螨抑菌活性。【结果】mlnB基因的敲除不仅导致W1菌株无法合成大环内酯A,还削弱了其对大白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯菌的拮抗活性,相比W1野生型菌株二斑叶螨的致死率73.33%～77.22%,大环内酯合成缺陷突变体的杀...     

生栀子杀螨活性物质的提取与分离

采用活性跟踪法,对生栀子(Gardenia)中的杀螨活性成分进行研究。通过对生栀子乙酸乙酯部分的萃取物进行分离和纯化,获得了2个具有较强杀螨作用的化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。采用色谱技术鉴定其化学结构分别为京尼平苷和熊果酸。试验结果表明,京尼平苷和熊果酸可能是生栀子中重要的杀螨活性物质。这2种化合物对朱砂叶螨的触杀活性的半致浓度(LC50)值分别为2.69 mg/mL、1.81 mg/mL。并发现当2种试剂的溶液中加入等浓度等体积的KOH溶液后,半致死浓度为0.94 mg/mL和0.95 mg/mL,其杀螨活性大幅度提高。     

8种杀虫剂对朱砂叶螨毒力及家蚕的急性毒性比较

采用叶碟喷雾法测定鱼藤酮、印栋素、苦参碱、苦皮藤素、藜芦碱、乙基多杀菌素、四氯虫酰胺、吡丙醚等8种常用杀虫剂对桑园朱砂叶螨成螨和螨卵的室内毒力,并以食下毒叶法检测对家蚕3龄起蚕的急性毒性。结果表明:印栋素、苦参碱、鱼藤酮、苦皮藤素、藜芦碱对朱砂叶螨成螨毒杀活性较高,半致死浓度(LC₅₀)分别为0.213、0.659、1.621、13.014、16.548 mg·L^-1;苦皮藤素、印栋素、藜芦碱、鱼藤酮和苦参碱对朱砂叶螨螨卵毒杀活性较高,LC₅₀值分别为0.254、3.497、13.564、21.936、35.030 mg·L^-1。3龄起蚕取食添加8种杀虫剂的桑叶48 h后,均出现吐液、拒食、体缩等中毒症状,除吡丙醚属于中等毒性外,其余杀虫剂对家蚕为高毒或剧毒。印栋素、苦参碱、鱼藤酮、苦皮藤素、藜芦碱等杀虫剂可以有效防控桑园朱砂叶螨成螨及螨卵,但在使用中应注意其对家蚕的安全性。     

蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线虫活性研究

【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用...     

朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶的表达纯化及其酶活测定条件优化

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是生物体内保证神经信号正常传递的关键酶,是有机磷和氨基甲酸酯类农药的作用靶标。现研究拟采用发酵罐培养含pET-30a/ace的表达菌株E.coli BL21(DE3),大量表达纯化螨AChE,利用单因素试验和正交试验优化AChE活性的测定条件。结果表明:发酵培养的重组菌株大量表达约为68kD的朱砂叶螨AChE蛋白。底物浓度、温度、pH和酶浓度等各测定因素对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性存在显著影响。确定朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性测定的最佳反应条件为:底物浓度1mmol/L,pH值7,温度35℃,酶浓度0.5mg/mL。通过体外发酵培养纯化获得了大量的朱砂叶螨AChE重组蛋白,确定了螨AChE活性测定的最佳条件,为进一步研究其酶学性质以及AChE抑制剂的体外筛选奠定基础。     

四种菊科蒿属植物精油杀螨活性及茵陈蒿挥发油成分分析

【目的】 筛选生物杀螨剂并分析和测定防治效果和毒力,为新型生物杀螨剂生物防治及应用提供理论依据。【方法】 分析4种菊科蒿属植物精油的杀螨活性,通过水蒸气蒸馏法提取植物的精油,用叶片浸渍法测定不同植物精油对土耳其斯坦叶螨的毒力。【结果】 茵陈蒿、一枝蒿、蒌蒿精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性较好,LC₅₀分别为17.49、18.17、22.26 mg/mL,其中茵陈蒿的活性最好,LC₅₀是阳性对照除虫菊提取物(LC₅₀=4.12 mg/mL)的4.24倍,稍弱于除虫菊提取物;黄花蒿精油的触杀活性最弱,半 深度LC₅₀为54.00 mg/mL。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对活性植物茵陈蒿的精油进行成分分析,从茵陈蒿精油中分离鉴定出33个化合物,主要成分为其主要成分为大根香叶烯 D(16.16%)、氧化石竹烯(10.42%)、石竹烯(8.70%)、a-毕橙茄醇(7.03%)、依兰油醇(4.83%)。【结论】 茵陈蒿对土耳其斯坦叶螨具有较好的触杀活性,有发展为天然杀螨剂的潜力。     

球孢白僵菌和中华甲虫蒲螨对冷杉梢斑螟杀虫作用及其相关酶活性影响

为研究球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和中华甲虫蒲螨(Pyemotes zhonghuajia)对冷杉梢斑螟(Dioryctria abietella)的毒杀作用及冷杉梢斑螟的解毒、保护机制，采用浸虫法和室内接种蒲螨的方法，测定了CFCC81428、CFCC83116这两株菌的亚致死浓度(LC₂₅)、半数致死浓度(LC₅₀)和中华甲虫蒲螨的亚致死数量(LD₂₅)、半数致死数量(LD₅₀)及幼虫被侵染或寄生后的累计校正死亡率。研究LC₂₅的CFCC81428菌株和LD₂₅的中华甲虫蒲螨对幼虫谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、乙酰胆碱酯酶(AChE)这2种解毒酶和多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)这3种保护酶的影响。结果表明：菌株CFCC81428对幼虫的毒力更强，其侵染幼虫第10天的LC₂₅、LC₅₀分别为2.04×10⁴、7.24×10     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与免疫原性鉴定

[目的]研究兔源多杀性巴氏杆菌C51-17株ompA基因表达与蛋白免疫原性鉴定.[方法]根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌序列AE004439设计引物,经PCR扩增出兔源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA基因,开放阅读框包含l 062 bp碱基,插入到pGEX-6p-1质粒,构建成功重组表达载体pGEX-dompA,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导高效表达出多杀性巴氏杆菌成熟重组外膜蛋白ompA.[结果]表达产物经SDS-PAGE分析,重组多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompA分子量在63 ku,Western blot分析显示,重组蛋白能与兔抗多杀性巴氏杆菌高免血清呈现免疫反应,表明表达的重组蛋白具有较好的免疫活性.[结论]获得的重组蛋白为家兔多杀性巴氏杆菌病诊断试剂盒和疫苗的进一步研究奠定基础.     

二斑叶螨高致死率虫生真菌菌株的筛选

为筛选防治二斑叶螨高致死率的虫生真菌菌株,为二斑叶螨杀螨剂的生产实践、广泛应用奠定理论基础,用5种虫生真菌7个菌株的分生孢子和芽孢子悬液,在温度27℃、湿度100％、浓度2×107个/mL条件下,对二斑叶螨雌成螨进行致死率筛选.结果表明:7d后,分生孢子悬液对二斑叶螨雌成螨的致死率从高到低依次为GZUIFR-HI201001、GZUIFR-HL2010、GZUIFR-HL2008、GZUIFR-Bb2010、GZUIFR-Pc2012,芽孢子悬液对二斑叶螨雌成螨的致死率从高到低依次为GZUIFR-H1201001、GZUIFR-H12008、GZUIFR-H12010、GZUIFR-Bb2010、GZUIFR-Pc2012、A3.4430、GZUIFR-Ps2010. 菌株GZUIFR-H1201001分生孢子和芽孢子的致死率均最高,分别是66.7％和100％.结论:虽然不同菌种或同种不同菌株以及同株不同培养方式所得的孢子对二斑叶螨雌成螨的致死率差别明显,但虫生真菌仍然是防治二斑叶螨极具潜力的微生物资源.     

啤酒花挥发油成分及其杀螨活性分析

【目的】测定4种植物精油的杀螨毒力,分析其有效成分,为新型植物性杀螨剂的研究提供理论依据。【方法】通过水蒸气蒸馏法提取4种植物精油,叶片浸渍法测定不同植物精油对土耳其斯坦叶螨的毒力。【结果】啤酒花、香青兰精油对土耳其斯坦叶螨的触杀活性较好,LC₅₀分别为13.30、26.28 mg/mL,其中啤酒花的活性最好;驱虫斑鸠菊、欧洲鳞毛蕨精油的触杀活性较弱,LC₅₀分别为47.50、83.09 mg/mL。通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对活性植物啤酒花的精油进行成分分析,从啤酒花精油中分离鉴定出48个化合物,主要成分为1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氢-γ-铬烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)以及石竹烯氧化物(7.99%)等。【结论】啤酒花精油杀螨活性较好,具有开发为天然杀螨剂的潜力。     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。     

藏乌头乙酸乙酯部位的杀螨活性研究

[目的]研究藏乌头乙酸乙酯部位的杀螨活性。[方法]利用从青海采集的藏头乌(Aconitum L.)进行层析分离提取其乙酸乙酯部位,测定该部位对植食性害虫朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)和二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)的杀虫活性。[结果]藏乌头的乙酸乙酯部位具有较强的杀螨活性,当提取物浓度达到250 ug/ml时,对朱砂叶螨和二斑叶螨的触杀活性分别达40%和30%以上,与市场使用的0.3%的苦参碱效果相当;以LC50进行比较,乌头乙酸乙酯提取物和对照药剂0.3%苦参碱对朱砂叶螨及二斑叶螨的LC50值的95%置信限均存在重叠,判断两者的毒力差异不显著。[结论]乌头乙酸乙酯提取物作为杀螨剂具有一定的应用价值。     

二斑叶螨多重抗性品系解毒酶基因表达模式解析

【目的】二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种重要的农业害螨,由于个体小、繁殖快等特点,极易产生抗药性,论文从生理生化和分子水平探讨二斑叶螨mRNA水平相对表达量的变化,旨在明确二斑叶螨对混剂的多重抗性机制,为该螨的综合治理提供依据。【方法】在温度（25±l）℃,相对湿度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室内条件下,于盆栽豇豆苗上饲养不接触任何药剂的二斑叶螨敏感品系（SS）和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿维菌素以其单剂的致死中浓度（LC50）为汰选浓度混合连续汰选的多重抗性品系（Mp-R）;Mp-R品系用药4-5次待其种群扩增后,参照FAO推荐的叶片残毒法进行室内毒力测定一次,计算其LC₅₀,求出抗性倍数（RR）,并记为一个汰选周期;连续汰选3个周期后,逐渐增加汰选浓度,用PoloPlus软件求其毒力回归方程、LC50、抗性指数及卡方值;采用生化分析法测定选育50代的二斑叶螨SS与Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S转移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarEs）、多功能氧化酶（MFOs）的活性,以ELFn为内参基因,采用RT-qPCR技术以比较Ct值的方法计算二斑叶螨Mp-R品系中10个与抗性相关的解毒酶基因的表达量。【结果】在室内经50代抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC₅₀分别达到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg·L^-1,抗性倍数分别为603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力显著高于SS品系,GSTs、CarEs比活力差异不显著;其他发育阶段Mp-R品系的GSTs、CarEs比活力显著高于SS品系,MFOs比活力则差异不显著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、CarEs比活力显著高于其他发育阶段,卵的MFOs比活力显著高于其他发育阶段。与敏感品系相比,二斑叶螨TuGSTd05、TuGSTd06与TuGSTd09基因表达量在Mp-R品系各发育阶段显著上调1.80倍以上,TuGSTd01表达量在若螨期显著上调1.63倍,其他发育阶段差异不显著;CYP392E10表达量在卵中极显著上调5.87倍,幼螨、若螨阶段显著上调2.15倍和2.09倍,成螨阶段表达量差异不显著;CYP392A6在卵、幼螨与若螨阶段表达量均显著上调1.89、1.64和1.59倍,在成螨阶段表达量差异不显著。CYP392A16在各发育阶段均极显著上调,卵中上调6.97倍,幼螨中上调8.20倍,若螨中上调8.88倍,雄成螨上调7.34倍,雌成螨上调8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表达量均显著上调2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨阶段表达量差异不显著;TuCCE35在若螨及雄、雌成螨中表达量显著上调1.58、1.86和2.65倍;TuCCE36在卵和雄、雌成螨中表达量显著上调1.73、1.89和2.14倍。【结论】与敏感品系相比,二斑叶螨Mp-R品系10个与抗性相关的解毒酶基因表达量在其不同发育阶段均有不同程度的变化。CYP392A16表达量在各发育阶段上调较大,可能参与了二斑叶螨多重抗性的形成;其余基因表达量均未见大幅度上调,这些基因是否参与了对3种药剂的代谢还需进一步验证。     

一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表达和酶学特性

运用基因克隆技术,以分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)CHN26菌株的基因组DNA为模板,经克隆鉴定该菌株是一种新型ATP-依赖型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因,全长585 bp,编码194个氨基酸,分子量约为21 ku。采用大肠杆菌(Eschericia coli)pET表达系统构建PlclpP基因表达质粒pET-28-PlclpP,并在大肠杆菌BL21中实现了重组PlClpP蛋白的表达。利用组氨酸标签(His-tag)亲和纯化法获得Pl ClpP纯化蛋白,发现Pl ClpP可能与宿主菌未知伴侣分子形成蛋白复合物。PlClpP复合物具有ATP-依赖型酪蛋白水解酶活性,最适反应温度为40℃、pH值7.0。表面活性剂强烈抑制PlClpP复合物的酶活性,而常规丝氨酸蛋白酶抑制剂对其活性没有抑制作用。本研究结果为蛋白酶新基因资源的开发、ClpP家族蛋白酶的基础理论和应用研究奠定了基础。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。