甘蓝型油菜带节子叶再生体系的建立及遗传转化应用

优良再生体系的建立是农杆菌介导植物遗传转化的基础。本研究建立以甘蓝型油菜含部分子叶节的子叶为外植体的再生体系,该再生体系为:切取5日苗龄甘蓝型油菜含部分子叶节的带柄子叶为外植体,置于添加3 mg/L6-BA的MS基本培养基中培养5天,外植体再生出丛生不定芽,不定芽再生率为100%。基于新建立的带节子叶再生体系,通过农杆菌介导,成功地将用p FGC5941载体构建的Bn TFL1基因干扰载体转入甘蓝型油菜中,从播种到得到生根抗性苗,整个转化周期只需要60~70天,较传统甘蓝型油菜以不带节子叶为外植体100~130天的转化周期大大缩短。     

油菜下胚轴农杆菌介导法转化影响因素探讨

利用甘蓝型油菜下胚轴为外植体，对油菜农杆菌介导转化中的主要因素进行了研究，并由此建立了油菜下胚轴农杆菌介导的遗传转化体系。研究发现，在农杆菌介导的油菜下胚轴转化中，较好的转化体系是：外植体在农杆菌侵染前进行3d的预培养。农杆菌的浸染浓度为OD600=0．2～0．4。共培养时的pH值为5．2。在转化后的分化培养基中附加30μmol／LAgNO3。     

农杆菌介导反义油酸脱饱和酶基因转化甘蓝型油菜

以甘蓝型油菜花油3号的子叶柄作为转化受体,利用农杆菌介导法,将反义油酸脱饱和酶基因导入甘蓝型油菜,获得了卡那霉素抗性植株。对再生植株进行PCR-Southern blotting检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。本文还进一步分析了影响遗传转化的一些因素。结果表明：对子叶柄进行适当的预培养,可以提高转化效率。延迟筛选也有利于提高转化效率。将处于对数生长期的农杆菌菌液稀释10倍后,外植体浸泡5-7min的转化效果最佳。     

十字花科黑腐病菌hrpW基因导入油菜之研究初报

为了研究十字花科植物黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc）hrpW基因的功能及Xcc的致病机理,实验以甘蓝型油菜为试验材料,以5~6d无菌苗的带柄子叶为外植体,建立了高效稳定的带柄子叶再生体系,同时探索了影响根癌农杆菌介导转化甘蓝型油菜子叶柄的各种因素;并用农杆菌介导法将hrpW基因导入甘蓝型油菜中,经PCR检测法分析,证明hrpW基因已整合到油菜基因组中。hrpW基因编码HarpinXcc（十字花科植物黑腐病菌Harpin蛋白）,该转基因植株的获得,为进一步研究十字花科植物黑腐病菌的致病机理提供了材料,也为选育高效抗病油菜种质奠定了基础。     

硝酸银在油菜基因转化中的影响作用

以芥菜型油菜DB3的下胚轴和子叶为外植体研究了不同浓度的AgNO3在油菜转化体系中的作用.结果表明AgNO3对于油菜下胚轴和子叶芽的分化是必须的,但是当AgNO3浓度超过某一临界值时又抑制愈伤组织的形成和外植体芽的分化.结果还发现未被农杆菌处理的外植体芽的分化所需的AgNO3最适宜的浓度为20 μmol/L,而被农杆菌处理过的外植体其分化所需的最适宜浓度增加为30 μmol/L.     

农杆菌介导法转化小麦的研究进展

农杆菌介导法具有操作简便、成本低、实用性强等诸多优点,广泛应用于小麦遗传转化。综述了农杆菌介导法转化小麦的敏感基因型筛选、外植体类型选择及转化体系优化方面的研究进展,对农杆菌介导法转化小麦前景进行了展望。     

根癌农杆菌介导的番茄高效遗传转化体系的研究

以番茄无菌苗的子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了优化,建立了高效番茄子叶和下胚轴农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.3)进行2 d的预培养浸染6 min的外植体在MS+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L IAA的培养基上转化效率最高.PCR检测初步证明,NPTII基因已整合到番茄再生植株中.     

大豆品种的再生性能及对EHA 101农杆菌的敏感性

大豆转化可利用农杆菌和子叶节转化系统,bar基因作为选择标记,草丁膦作为选择试剂.用5-6 d发芽的种子的子叶节作外植体,在子叶节处划5-6下,用含pPTN 140的农杆菌EHA 101感染后,共培养3 d,用含抗生素的洗液洗去外植体上的农杆菌,将外植体放入5 mg/L草丁膦的长芽培养基,两周后统计不同大豆品种的再生率,4周后做GUS染色对含pPTN1     

甘蓝型油菜下胚轴一步不定芽再生培养及遗传转化应用

本研究建立了以甘蓝型油菜下胚轴为外植体的一步不定芽再生培养和遗传转化体系。首先,以甘蓝型油菜中双11号含部分子叶节的下胚轴为外植体,从6-BA和NAA配比、Ag NO3以及无菌苗苗龄等方面对影响油菜组织培养的因素进行了研究,建立了甘蓝型油菜快速高频一步不定芽再生培养技术体系。该技术体系为,切取5 d苗龄含部分子叶节的下胚轴置于添加4 mg/L 6-BA的MS基本培养基中培养,5 d再生出不定芽,再生频率为100%。在此基础上,进行了甘蓝型油菜的遗传转化,成功地将用p FGC5941双元载体构建的Bn TFL1基因干扰载体转入中双11号中。整个转化过程中,芽的诱导生成只需5 d,接着完成抗性芽的PPT筛选需要30 d,整个转化周期从播种到得到生根抗性苗仅需大约70 d,而传统转化方法抗性芽的诱导筛选需要90 d,整个转化周期需要130 d左右,大大缩短了转化周期,简化了转化过程,提高了转化效率。     

根癌农杆菌介导TA29-Barnase基因转化甘蓝型油菜的研究

经比较影响农杆菌介导Barnase嵌合基因转化甘蓝型油菜的各种因素后,建立了高效稳定的转基因实验体系.按该体系,甘蓝型油菜"湘油15"子叶柄预培养20 h,OD600为0.5农杆菌菌液感染后共培养3 d,在MS+2 mg*L-1 AgNO3+4.5 mg*L-1BA+10 mg*L-1 Km+300 mg*L-1 Carb培养基上进行选择,转化率为8.8%,PCR检测和Southern杂交检测证明外源基     

用in planta方法转化甘蓝型油菜

用in planta方法进行遗传转化极大地促进了模式植物拟南芥的功能基因组研究,但在农作物中仍少有in planta的成功报道。我们采用in planta方法,用含有质粒pSG529、pHTT613和ApSCO的农杆菌菌株转化中油821、湘油13、宁RS-1、S2501-1、华双3号等甘蓝型油菜品种。在适宜的条件下,将根癌农杆菌菌液浸染甘蓝型油菜花序10 d至15 d     

农杆菌介导法将LFY基因导入嘎拉苹果的研究

以嘎拉苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化.结果表明:卡那霉素(Km)选择压在30 mg/L时,外植体预培养2～3 d后以OD600=0.3～0.5农杆菌菌液浸泡3～5 min,共培养3 d,延迟筛选3 d可明显提高M2叶片转化效率,GUS阳性率达50%.PCR检测初步证明,LFY基因已整合到苹果再生植株中.     

根癌农杆菌介导番茄‘白果强丰’遗传转化体系优化

以番茄无菌苗的子叶为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化,结果表明：外植体在MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的进行2天的预培养后,用农杆菌EHA105（浸染浓度为OD600=0.6）浸染6 min,转化效率最高,经过PCR检测初步证明NPTII基因已整合到番茄再生植株中,本研究建立了高效番茄‘白果强丰’子叶农杆菌介导的遗传转化体系。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

甘蓝型油菜透明种皮12（TT12）基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。     

农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(Glycine max L.) 吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30、开育12的子叶节为外植体,用LBA4404 农杆菌（含pPC-KSA质粒）研究了影响大豆子叶节转化的因素。结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2.16%,单次最高转化率达6.12%;中黄28次之,平均转化     

转IPT基因油菜提高抗蚜虫能力

本研究利用农杆菌介导IPT(isopentenyl-transferases,异戊烯基转移酶)基因转化喀斯特特有甘蓝型油菜自交品种S65,在无激素的筛选培养基中获得再生植株14株,PCR检测12株外源基因整合入油菜基因组中.对其中5株转基因植株及5株野生型植株人工接种蚜虫试验,研究超量表达IPT基因油菜对蚜虫的抗性.结...     

甘蓝型油菜BnaABI4基因CRISPR/Cas9编辑载体的构建及甘蓝型油菜转化

ABI4(Abscisicacid-insensitive4)是ABA响应途径中重要的转录因子。本研究以甘蓝型油菜全基因组数据库为基础,借助拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,通过序列比对,获得了甘蓝型油菜的2个BnaABI4,分别命名为BnaABI4-A (GenBank登录号为BnaA03g18970D)和BnaABI4-C (GenBank登录号为BnaC03g725-10D)。在这两个基因的CDS序列上寻找一段长度为20 bp、序列相同的片段作为基因编辑的目标位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体pCAMBIA1300-sg RNA/Cas9-BnaABI4;借助根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化法,成功将BnaABI4的基因编辑表达框转入甘蓝型油菜‘湘油15’中,共获得转基因植株13株,这将为深入研究甘蓝型油菜BnaABI4的生物学功能提供科学依据。     

甘蓝型油菜BnaLCR23基因CRISPR-Cas9表达载体的构建及遗传转化

BnaLCR23基因是甘蓝型油菜"湘油15号"种子不同发育时期抑制差减杂交文库中的一个功能未知基因,分析表明其功能可能与种子发育和油脂代谢相关,为了明确该基因的功能,本研究基于CRISPR-Cas9基因编辑系统构建了该基因的敲除质粒。利用根癌农杆菌介导的油菜下胚轴遗传转化方法将敲除质粒转入甘蓝型油菜中,经潮霉素抗性筛选以及抗性苗基因组DNA的PCR检测,获得转基因油菜。转基因油菜材料的获得为深入研究BnaLCR23基因在甘蓝型油菜种子发育和储存物的积累过程中的功能提供了帮助。     

根癌农杆菌介导白细胞介素-4基因转化甘蓝(Brassica oleracea L.)研究

利用根癌农杆菌介导法,以白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)基因转化中甘11号甘蓝.本研究对可能影响il-4转化率的外植体类型、外植体的预培养时间、农杆菌的侵染时间以及外植体与农杆菌的共培养时间进行了优化.试验结果表明:il-4基因对带1～2 mm子叶柄的子叶的转化率显著高于下胚轴;带柄子叶在预培养1 d、侵染3 min、共培养1 d时,转化效果最好,转化率达23.3%;下胚轴在预培养1～3 d,侵染3～5 min,共培养1～2 d时,转化效果较好,转化率最高可达13.3%.经PCR检测及PCR-Southern杂交,初步证明目的基因il-4已经转入甘蓝的再生植株.转il-4基因甘蓝的PCR阳性再生植株已经开花并产生了后代.