小麦TaAlaAT基因的克隆及镉胁迫下表达分析

为了研究AlaAT基因在小麦应对镉胁迫中的功能,以镉处理小麦为试验材料,利用mRNA差异显示技术DDRT-PCR、RT-PCR从小麦cDNA中克隆得到AlaAT基因全长,将其命名为TaAlaAT。用生物信息学方法对TaAlaAT的基因序列和蛋白质氨基酸序列进行分析,进一步用MEGA 6.0软件构建进化树;用qRT-PCR研究TaAlaAT基因在小麦不同组织中以及镉胁迫后的相对表达水平。序列分析结果表明,该基因全长为1 628 bp,包含1个长度为1 440 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),其编码479个氨基酸,蛋白质分子量约为53.41 ku,等电点为6.97,该蛋白质属于天冬氨转氨酶家族,与水稻(Oryza sativa L.)AlaAT蛋白的相似性较高。qRT-PCR结果表明,TaAlaAT在小麦中具有组织特异性,在根部的表达水平最高,在镉胁迫处理后,TaAlaAT基因表达量呈现先升高后降低的趋势。由研究结果可以看出,TaAlaAT基因能够响应镉胁迫。     

大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及其在烟草中的表达

利用PCR克隆了大肠杆菌甜菜碱醛脱氢酶基因(betB),构建了含betB基因的重组植物表达质粒载体pLM47,并用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草叶片进行遗传转化。结果表明,在含有潮霉素的MS筛选分化培养基上筛选,获得基因转化烟草植株3株;经报告基因GVS的组织化学检测和Western blot检测,证明betB基因在烟草转化植株中得到了表达。     

烟曲霉WY-1植酸酶基因的克隆及其在烟草中的表达

以自行筛选的烟曲霉WY-1为出发菌株,通过PCR方法克隆其植酸酶基因,并构建了含有植物信号肽序列的植酸酶基因植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法对烟草叶片进行了遗传转化.结果表明,PCR鉴定和Southern杂交分析说明植酸酶基因已整合到烟草的基因组中;RT-PCR检测结果证实了植酸酶基因已得到转录表达;酶活性分析表明功能性的植酸酶已成功表达在烟草中,这是烟曲霉植酸酶基因在烟草中的首次表达.     

烟草糖基转移酶基因启动子片段B的克隆与诱导表达

利用从烟草中克隆的一个新糖基转移酶(Glucosyitransferase,GTs)基因启动子中具有茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的片段,与GUS(β-glucuronidase)报告基因连接,构建部分启动子片段缺失载体.利用农杆菌介导的叶盘转化法,获得了转基因植株,不同片段载体转基因植株的阳性率为50%～71%.对阳性转基因烟草植株GUS诱导活性的定量分析结果表明,在构建的4个表达载体中,启动子片段BA的基础表达水平非常低,并且不同转基因植株中都存在SA和MeJA双重诱导特征:片段BB和BC基础表达水平较高,不同转基因植株对SA和MeJA的反应不同:对于启动子片段BD,基础表达高于BA片段而低于BB和BC,不同转基因植株GUS活性均受SA诱导.推测在-756～-703之间(BA)存在MeJA和SA双重诱导元件,在-643～-606存在SA的诱导元件.对这些诱导元件的确定,有助于水杨酸和茉莉酸甲酯诱导机理的研究.     

烟草WRKY8基因的克隆与表达分析

利用数据库资源和RT–PCR技术获得烟草WRKY8基因,序列分析表明,该基因包含1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸。基因编码的蛋白含有2个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2H2(C–X4–5–C–X22–23–H–X1–H)。推测其可能定位于细胞核并具有复制转录及调控的功能,从而参与对植物生长发育和胁迫应答的调节。RT–PCR结果表明,NtWRKY8基因受低温诱导表达。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

根据烟草蚀纹病毒(TEV)CP序列设计合成上下游引物,利用RT-PCR方法获得了TEV CP基因,大小为789 bp。将TEV CP基因克隆到pM D 18-T S im p le V ector,经E coRⅠ/S acⅠ双酶切得到目的片段,并将其定向插入到pET 30a载体中构建了原核表达载体pET 30-TEV CP,重组质粒经E coRⅠ和S acⅠ双酶切鉴定及基因测序验证正确后,转化大肠杆菌BL 21,用IPTG进行诱导表达。结果表明,TEV CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,分子量约为37 ku。以表达产物为抗原免疫家兔,制备了特异性抗血清,其效价为1/1 204。W estern b lot检测结果表明,制备的抗血清可用于检测田间的发病植株。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

非洲菊CAT2基因的克隆及表达

为研究非洲菊过氧化氢酶(CAT)基因的序列特性及其在不同逆境处理下的表达水平,以‘玲珑’非洲菊为材料,利用RT-PCR技术成功克隆获得了一个编码序列(CDS)长度为1 479 bp的CAT基因,对该基因及其编码蛋白进行了生物信息学分析,同时利用qRT-PCR技术研究了其在不同组织器官和不同胁迫处理下的表达水平.结果显示,CAT基因可编码492个氨基酸、分子质量为56.854 ku、等电点为6.5、无信号肽和跨膜结构的稳定亲水蛋白.其编码蛋白定位于过氧化物酶体,含有典型的CAT保守结构域和血红素结合位点.序列比对结果显示,非洲菊CAT基因与刺苞菜蓟CAT2基因的相似度最高,达88.00%,故将其命名为GjCAT2.进化分析显示,该蛋白与莴苣等菊科植物CAT的亲缘关系最近.GjCAT2基因在非洲菊花茎中的相对表达量最高,分别为叶、叶柄和花蕾的31.82、7.48和10.75倍.在聚乙二醇(PEG)模拟干旱和低温胁迫下,GjCAT2基因的相对表达量均呈“升—降—升”的趋势,分别于处理4和8 h时达到最大值;接种隐地疫霉初期,GjCAT2基因的表达受到极显著抑制,但侵染6 d时的相对表达量骤升...     

烟草高亲和钾转运蛋白基因NtHAK5克隆及表达模式分析

【目的】克隆烟草高亲和钾转运蛋白基因（NtHAK5）,并分析其在不同非生物胁迫下的表达模式,为深入探究该基因在烟草抵御低钾胁迫等非生物胁迫中的功能和作用机制提供理论参考。【方法】从普通烟草K326中扩增NtHAK5基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并构建pBWA (V) HS-NtHAK5-GLosgfp融合表达载体,通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞,观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NtHAK5基因在不同组织和不同非生物胁迫条件下的表达特性,以无胁迫处理（正常供钾2 mmol/L K+）的植株为对照（CK）。【结果】烟草NtHAK5基因CDS序列全长2418 bp,共编码805个氨基酸残基,其编码蛋白的分子量为89874.00 Da,理论等电点（pI）为8.65,属于稳定性疏水蛋白,含有HAK家族蛋白典型的跨膜结构域。NtHAK5基因的二级结构中α-螺旋占40.12%,延伸链占24.97%,无规则卷曲占26.21%,β-折叠占8.70%。NtHAK5蛋白与烟草NtHAK1和黄花烟草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分别为40.69%和40.44%,与拟南芥AtHAK5相似性最高,为58.26%。NtHAK5基因启动子含有厌氧、低温、干旱、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应的相关顺式作用元件。NtHAK5蛋白定位在细胞膜上。低钾胁迫处理下和正常供钾（CK）条件下,NtHAK5基因在根、茎、老叶和新叶中均有表达,且均以老叶中相对表达量最高。NtHAK5基因在干旱胁迫、冷害处理、盐胁迫和低钾胁迫下的相对表达量显著高于CK （P<0.05）,但在低氮和低磷条件下的相对表达量与CK无显著差异（P>0.05）。【结论】 NtHAK5基因属于HAK基因家族成员,具有明显组织表达特异性,参与烟草植株对干旱胁迫、冷害胁迫、盐胁迫和低钾胁迫等非生物胁迫响应,推测其编码的蛋白在烟草组织中作为K+转运体参与非生物胁迫下K+的吸收、转运和再利用。     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

烟草类萜生物合成途径中关键酶基因的克隆与表达调控

萜类化合物是烟草重要的香气前体物质,它们的降解产物是烟草最重要的香气来源之一.本研究概述了类萜代谢途径及其相关酶类的克隆与表达调控的研究进展,并对利用类萜代谢工程调控该代谢途径来提高烟草香气品质的应用前景进行了展望.     

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆VvGW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物.采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆.利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式.结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为VvGW2基因.VvGW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68.该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型.与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47％ ～53％.根据VvGW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类.实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,VvGW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高.不同葡萄品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低.表明VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关.     

烟草质膜ATPase4基因的克隆、表达载体构建及表达分析

植物细胞质膜ATPase基因表达可以引起细胞向外界环境释放H⁺,从而形成细胞膜内外的电化学式梯度,促进各种离子的运输,抵抗外界的各种胁迫。为研究ATPase基因在烟草中的非生物胁迫调控机制及相关生物学功能,本研究采用同源克隆的方法,从普通烟草K326中克隆到了1个ATPase4同源性基因,成功构建ATPase4-pcambia1300过表达载体。利用生物信息学分析ATPase4基因编码蛋白的疏水性、理化性质、蛋白结构预测、信号肽预测、磷酸位点预测及同源性分析,结果显示,该基因与绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)质膜ATPase4具有99%同源性,故命名为质膜ATPase4基因。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)测定该基因在烟草组织中的表达量及其在非生物逆境胁迫中的表达模式,结果表明,该基因在根中表达量最高,且能快速响应低钾、高盐、PEG和冷胁迫诱导,说明ATPase4基因在烟草逆境胁迫中发挥着重要的调节作用。     

百合LoNHX2基因的克隆与表达分析

[目的]为了解决百合在北方盐碱地区百合种球生长和产量的问题.[方法]以OT型百合'Robina'为材料,克隆了百合液泡膜钠氢逆向转运蛋白基因(LoNHX2),并使用前期试验得出的半致死浓度200 mM NaCl对百合种球进行处理,通过荧光定量分析百合LoNHX2基因在盐处理后不同时间及不同部位的表达状况.[结果]结果表明:(1)百合LoNHX2基因全长为1 608 bp,编码525个氨基酸;(2)百合LoNHX2蛋白性质稳定,由20种氨基酸组成,为脂溶性蛋白;(3) 200 mM NaCl对百合种球根系进行盐胁迫处理后,LoNHX2基因在百合根部的表达量随时间变化,呈先上升再下降趋势;(4)对百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表达量分析,LoNHX2基因在花瓣中表达量最高,其次是叶片、茎、根,表达量最低的是鳞茎.[结论]发现百合LoNHX2基因在盐胁迫中有重要作用,可通过降低细胞质中Na+的浓度,从而降低高盐胁迫对植物细胞的伤害.为百合种球耐盐分子育种提供理论依据,对百合在北方产业化发展及园林应用方面具有重要意义.     

烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因全长ORF的克隆与原核表达

采集河南自然发病的烟草.通过摩擦接种至实验室烟草后直接提取总RNA,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得了烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-HN CP)基因;经Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理的PCR产物,连接克隆至大肠杆菌表达栽体pET28a( ),构建了重组质粒pPVYCP,所获得的重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实正确插入了PVY-HN CP基因的全长ORF.序列分析表明,PVY-HN CP基因由804个核苷酸组成,编码267个氨基酸残基;重组的pPVYCP表达载体转化大肠杆茵BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导.SDS-PAGE电泳显示分子量为32 kDa的CP蛋白得到了诱导表达.     

烟草花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。     

利用烟草的cDNA酵母表达文库筛选镉胁迫相关基因

为了鉴定烟草在重金属镉胁迫处理下的功能基因,构建烟草cDNA酵母表达文库,并利用镉敏感的突变株对文库进行初步筛选。首先将烟草幼苗进行重金属胁迫处理,然后取幼根提取总RNA并纯化mRNA,采用SMART技术反转录成双链cDNA,将cDNA与入门载体pDONR222的同源重组区连接,再转到酵母表达载体pDEST22上,构建了Gateway技术兼容的酵母cDNA表达文库。经检测,构建的cDNA酵母表达文库滴度为4.32×106 cfu/mL,库容量为0.86×107 cfu,平均插入片段长度大于1kb,文库质量较高。通过镉敏感酵母突变株Δycf1筛选烟草重金属镉胁迫相关基因,获得酵母单克隆70个。经分析可知,其涉及到谷胱甘肽转移酶、铜分子伴侣及甲硫蛋白等24个不同蛋白基因,初步鉴定为烟草应答重金属镉胁迫的候选基因。     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。