鸡源禽流感病毒的分离和鉴定

禽流感（ＡＩ）是由正粘病毒感染引起的一种传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其它野禽均可感染。感染后可表现为亚临诊症状到无症状带毒等多种形式。以产蛋量大幅度下降、呼吸困难、拉黄白色稀粪为主要特征。由于禽流感病毒的抗原漂移 ,其毒力及血清亚型不断变化给该病的诊断和工作带来极大的困难。因此 ,鉴定疫区病毒特性对预防ＡＩ的爆发和流行具有十分重要的意义。现将该病的流行特点及病毒分离鉴定结果报告于后。１材料和方法１．１材料病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡 :禽流感Ａ型ＮＰ抗原标准阳性血清 ,…     

绵羊骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定

旨在分离绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow mesenchymal stem cells, SBMSC),建立绵羊骨髓间充质干细胞系,为相关研究提供种子细胞。取新生健康绵羊肋骨为试验材料,利用贴壁法分离获得SBMSC;取生长良好的P3代细胞通过免疫荧光,进行CD73、CD90、CD105、CD106表型鉴定;取生长良好的P3代细胞分别进行成软骨、成脂、成骨方向的诱导,对诱导结果分别进行阿利新蓝、油红O和茜素红染色,鉴定分化结果。SBMSC呈成纤维样贴壁生长;体外培养P3代细胞表面标记物CD73、CD90、CD105和CD106完全符合标准;P3代细胞经软骨、脂肪、骨方向诱导3周后,经阿利新蓝染色,细胞呈亮蓝色;经油红O染色,细胞质内出现橙红色脂滴;茜素红染色表明聚集的细胞团中央能形成钙化结节。说明SBMSC经体外诱导培养后可向软骨细胞、脂肪细胞和成骨细胞分化,并具有明显的成软骨、成脂和成骨表型,表明SBMSC具有多向分化潜能。通过贴壁培养法建立了SBMSC完整的体外培养体系,为绵羊育种等方面提供种子细胞。     

犬骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

为了证明全骨髓贴壁法分离培养犬骨髓间充质干细胞的可行性,为后续移植试验提供活性良好的种子细胞,试验采用全骨髓贴壁法分离纯化犬骨髓间充质干细胞,并通过细胞形态观察、表面标记流式分析、体外诱导分化对细胞进行鉴定。结果表明:分离培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形、集落样生长,表面标记CD44呈阳性,CD34、CD45呈阴性,能够向成骨细胞和心肌样细胞分化。说明全骨髓贴壁法便捷可行,获得的犬骨髓间充质干细胞纯度高,增殖旺盛,分化能力良好。     

奶牛脂肪间充质干细胞体外分离培养与鉴定

探讨奶牛脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)体外分离培养方法及其生物学特性。采集不同部位奶牛脂肪,选用0.25%胰蛋白酶消化,并进行贴壁培养,获取原代奶牛AD-MSCs,通过传代培养进一步纯化扩增。显微镜观察细胞形态及生长特征,并采用MTT法绘制2种AD-MSCs生长曲线,利用免疫荧光化学染色法检测其表面标志物,对该细胞进行了向成骨及成脂诱导分化培养试验,采用油红O和钙盐染色法对其分化能力进行鉴定。比较研究了不同部位脂肪的形态,2种不同部位的AD-MSCs均呈长梭形、纺锤形或多角形贴壁生长,且2个部位来源的AD-MSCs的生长曲线无明显差异(P0.05)。分离培养的AD-MSCs的表面标志物CD44和CD73呈阳性表达,而CD34和CD45呈阴性表达。在诱导分化培养试验中呈现出较强的成脂和成骨分化能力。本试验选取不同部位的脂肪组织,成功的分离并鉴定了奶牛AD-MSCs,为纯化鉴定奶牛AD-MSCs提供了依据。     

鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定

从发病率颇高的产蛋鸡群和死亡率达３０％以上的肉鸡群病例中，先后分离到６株Ａ型禽流感病毒。这些分离株可在鸡胚中传代。可以凝集鸡红细胞而不被新城疫阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成的ＡＧＰ抗原与禽流感阳性血清在ＡＧＰ试验中出现白色的沉淀线。用ＡＩＤ９３～１分离株与１５个标准ＨＡ亚型和９个标准ＮＡ亚型的标准血清进行ＨＩ试验，结果鉴定出ＡＩＤ９３～１毒株的血清亚型为Ｈ９Ｎ３。其余５个分离株均可被ＡＩＤ９３－１株的高免血清所抑制。人工复制病例出现明显的临诊症状，可缓慢康复，不引起死亡。用日龄较小的ＡＡ鸡与攻毒鸡同居能感染发病，并引起１／５死亡。健康产蛋母鸡与发病鸡群同场饲养也可感染发病，并引起产蛋下降。这些分离株具有良好的免疫原性。通过电镜观察符合流感病毒的形态特征，病毒粒子的直径为８０～１２０ｎｍ。     

禽流感研究：I.鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定

从发病率颇高的产蛋鸡群和死亡率达３０％以上的肉鸡群的病例中，先后分离到６株Ａ型禽流感病毒。这些分离毒株可在鸡胚中传代。可以凝集鸡红细胞，不被新城疫阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成的ＡＧＰ抗原与禽流感阳性血清在ＡＧＰ试验中出现白色的沉淀线。用ＡＩＤ＿（９３－１）分离毒株与１５个标准ＨＡ亚型的标准血清进行ＨＩ试验，结果鉴定出ＡＩＤ＿（９３－１）毒株的ＨＡ亚型为Ｈ＿９。至于神经氨酸酶（ＮＡ）有待于今后测定。其余５个分离毒株的血凝素可被ＡＩＤ＿（９３－１）毒株的高兔血清所抑制。人工复制病例出现明显的临诊症状，可缓慢康复，不引起死亡。这些分离毒株具有良好的免疫原性。通过电镜观察符合流感病毒的形态特征，病毒粒子的直径为８０～１２０ｎｍ。     

鸭源禽流感病毒的分离和鉴定

从南京鸡鸭加工厂、孝陵卫鸭场及迈皋桥鸭场共采制１１３个泄殖腔拭子,用鸡胚尿囊腔接种传代法分离到４株禽流感病毒（ＡＩＶ）,每个样品均有ＮＤＶ混感。纯化后的分离株利用电镜负染技术观察到典型的ＡＩＶ粒子。琼扩试验证明４个分离株均为Ａ型流感病毒。经血凝素亚型分析,４株均属于Ｈ９亚型。致病性试验结果表明,４株鸭源禽流感病毒对鸡均表现为较低的致病力。本研究提示环境（特别是水体）保毒是ＡＩＶ得以长期存在和传播的重要因素和媒介。     

禽流感病毒的分离与鉴定技术

禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒,检测其血凝活性,并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒,再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。如果是H5或H7亚型,还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。     

西门塔尔牛牙龈间充质干细胞的分离鉴定及诱导分化

本研究旨在建立西门塔尔牛牙龈间充质干细胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）体外分离培养体系,并对其生物学特性进行探讨,为细胞治疗、再生医学等提供种子细胞。取14周龄西门塔尔牛牙龈,采用0.1%Ⅳ型胶原酶消化法分离GMSCs,进行体外培养和冷冻保存,测定冻存前后细胞活率,MTT检测法绘制GMSCs生长曲线;通过免疫荧光、流式细胞术和PCR等方法鉴定西门塔尔牛GMSCs特异性标记物（CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166和STRO-1）,并通过体外成脂、成骨诱导检测其多向分化潜能。结果表明,西门塔尔牛GMSCs折光性强、贴壁后呈长纺锤形;冻存前和复苏后细胞的活率检测结果显示,细胞复苏后的活率均小于冻存前的活率,但均维持在85%以上,细胞生长曲线呈典型的S型;免疫荧光结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD29、CD105和STRO-1,不表达CD31;PCR结果显示,西门塔尔牛GMSCs表达CD44、CD73、CD90和CD166,不表达CD34和CD45;流式细胞术结果显示,西门塔尔牛GMSCs高表达CD73（99.94%）、CD90（99.87%）和CD105（99.90%）,几乎不表达CD34（1.16%）和CD45（1.18%）;成脂诱导分化后,可见大小不一的脂滴,脂滴可被油红O染色,且PCR检测结果表明其表达成脂关键基因过氧化物酶体增殖因子活化受体-γ（PPAR-γ）和脂蛋白酶（LPL）;成骨诱导分化后,可见被茜素红染色的矿化结节,且PCR检测结果表明其表达成骨关键基因Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）和骨桥蛋白基因（OPN）。综上,本研究成功分离出西门塔尔牛GMSCs,建立了西门塔尔牛GMSCs体外分离、培养体系,并通过成脂和成骨诱导分化证明其具有多向分化潜能,结果可为再生医学和牙齿修复等研究提供参考。     

禽流感病毒河北株的分离鉴定

禽流感（Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）是由 Ａ型流感病毒引起的一种禽类的病毒性传染病,被国际兽疫局确定为Ⅰ类烈性传染性病。该病毒属正粘病毒科,几乎所有的野生与家养禽类均可感染。１８７８年在意大利的鸡群中首次暴发,其后许多国家和地区都相继报道ＡＩＶ存在的事实,近几年,我国在不同地区都分离到禽流感病毒,广泛存在的主要是Ｈ９亚型病毒,且多为中等以下毒力的毒株。本试验采集病料主要针对河北省养鸡业较为发达的几个县市的七个小型养鸡场,选择未注过流感疫苗,临床症状出现产蛋下降和呼吸道症状严重的鸡只,剖杀,采集病变明显的脏器,如胰、肝、肺、脾、气管、肾、泄殖腔及其干酪样物等,剪碎研磨,加抗生素处理后,接种９－１０日龄鸡胚,弃掉２４小时内死亡的鸡胚,收集２４－７２小时死亡鸡胚的尿囊液,盲传三代,并做血凝试验,对于ＨＡ阳性的样品,进一步做ＨＩ试验,结果有２株禽流感病毒为Ｈ９亚型;进一步测定其神经氨酸酶活性,结果为Ｎ２。取１： １０稀释的尿液０．２ｍｌ肌肉接种８只８周龄ＳＰＦ鸡测其致病力指数,观察１０天内鸡只发病情况,结果第三天鸡群精神稍有沉郁,其中一只出现歪脖的神经症状,采用英国中心兽医实验室静脉致病指数（ＩＶＰＩ）测定计算方法     

白来航鸡不同来源间充质干细胞的比较研究

【目的】以禽类间充质干细胞(MSCs)为研究对象,探讨不同来源MSCs生物学特性上的差异及其临床应用潜力。【方法】培养白来航鸡4种不同组织器官骨髓(BM)、脂肪(AT)、脐带(UC)和脾脏(S)衍生的MSCs,通过实时荧光定量PCR技术检测细胞表面标记物的表达,采用细胞生长曲线观察种群倍增时间变化,利用噻唑蓝细胞毒性检测法(MTT)确定基质细胞衍生因子1(SDF-1)对不同来源MSCs的细胞毒性,并选用细胞小室检测MSCs体外迁移情况,通过蛋白质印迹法方法确定MSCs体外迁移影响因素,最后选用成骨分化和成脂分化观察不同来源MSCs的体外分化情况。【结果】不同来源的MSCs细胞形态基本一致;细胞表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90和CD105等基因呈阳性表达;不同来源的MSCs表面标记物的相对表达量不同,CD29基因的相对表达量基本相同,CD44基因在AT-MSCs中的相对表达量显著高于BM-MSCs(P<0.05),CD71基因在UC-MSCs中的相对表达量显著低于BM-MSCs(P<0.05),CD90基因在UC-MSCs和S-MSCs中的相对表达量极显著低于...     

鸭源禽流感病毒的分离鉴定及特性研究

从湖北某鸭场采集泄殖腔棉拭子20份,通过传统的禽流感病毒分离方法即鸡胚尿囊腔接种法分离到1株鸭源禽流感病毒(AIV).血清学试验表明,该病毒分离株为A型流感病毒,经血凝素亚型鉴定为H9型,与禽流感病毒H9亚型标准阳性血清的血凝抑制(HI)价为8 log2,电镜负染拍照后,可清楚观察到典型的流感病毒粒子形态;致病性试验表明,该流感病毒对鸡表现为较低的致病力.研究表明,水禽,特别是鸭,正日益成为禽流感的高度易感动物,是AIV生态循环中重要的一环.     

H9N2亚型鸡源禽流感病毒分离与鉴定

禽流感 (AI)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟 ,是由正粘病毒科 A型流感病毒引起的一种传染病 ,是国际兽医局规定的 A类烈性传染病。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及其他野禽均可感染。我们从新乡市某蛋鸡场分离鉴定 1株低致病力的 H9N2亚型的禽流感病毒毒株 ,现报告如下。1　材料与方法1.1　材料　病料来自河南职业技术师范学院禽病研究所接诊检验的病、死鸡。禽流感 A型琼扩抗原、标准阳性血清以及抗 HA、NA分型血清购自中国农科院哈尔滨兽医研究所 ;抗新城疫 (ND)血清和抗减蛋综合征 (EDS- 76 )血清由本院禽病研究所提供。 SPF鸡胚和雏鸡购自…     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养

旨在对山羊的骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行分离培养。将分离得到的BMSCs进行传代培养,采用RT-PCR法检测其干细胞转录因子oct4和sox2基因,以验证其干细胞特性;在此基础上绘制BMSCs的生长曲线,对其生物学特性进行直观了解。结果表明,分离到的山羊BMSCs原代细胞呈现出成纤维样,并能够表达oct4和sox2基因,证明了其干细胞特性;其生长曲线呈"S"型,在1~2 d时为潜伏期,第3天时进入指数生长期,第7天时进入平台期。结果提示,分离得到的细胞具有BMSCs的特性,能够用于后续的相关试验研究。     

鸡安卡拉病毒分离鉴定方法

本文主要从病原学、发病情况、临床症状和病理剖检变化4个方面概述鸡安卡拉病毒,并详细阐述安卡拉病毒分离鉴定方法,直接免疫荧光抗体试验、双抗体夹心法ELISA检测病毒抗原、PCR检测、动物回归实验和病毒分离,及时准确掌握临床发病情况,及早发现并采取必要的手段控制传染病的暴发。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

骨髓间充质干细胞及其应用

间充质干细胞因具有多向分化潜能及植入体内无排斥反应等特性而被广泛应用于医学领域。作者就骨髓间充质干细胞的生物学特性、分离培养和鉴定及应用作一综述。     

朗德鹅禽流感病毒的分离与鉴定

用禽流感病毒ELISA试剂盒对某朗德鹅养殖场的病鹅气管粘液进行了检测，发现5份粘液样本均呈禽流感阳性；随后取相应气管组织材料接种于9～11日龄鸡胚分离病毒．发现尿囊液能使鸡红细胞发生凝集，用禽流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒抗血清作HI试验，结果禽流感病毒H5亚型抗血清的血凝抑制滴度达到2^7，而禽流感病毒H7、H9亚型及其他病毒抗血清无血凝抑制滴度，说明从朗德鹅分离到的病毒为H5亚型禽流感病毒。     

鸡传染性贫血病毒的分离鉴定

本试验于１９９２年自东北某地疑似鸡传染性贫血鸡群得到一分离物，该发离物能抵抗７０℃５分钟处理，对氯仿不敏感，不凝集鸡，小白鼠，绵羊红细胞，可引起１日龄ＳＰＦ鸡发病，表现出传染性贫血的特征病变，分离物能被鸡传染性贫血病毒抗血清中和，能在ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞上适应增值并与参考毒ＧｉＦｕ－１，ＣＵＸ－１，ＴＫ５８０３在该细胞培养中产生一致的细胞病变，分离物与参考毒感染的ＭＤＣＣ－ＭＳＢ１细胞用间接免疫     

滩羊骨髓间充质干细胞分离与培养

利用全骨髓法与差速贴壁法分离和培养滩羊骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察细胞形态及成脂诱导分化实验进行鉴定。结果显示原代培养的细胞呈圆形或三角形,24h后大部分细胞均贴壁,7d左右可达80％-90％融合,体外成脂诱导分化获得脂肪样细胞,油红染色为阳性。因此,全骨髓法与差速贴壁法可有效分离培养滩羊的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。