体内注射鸡Toll样受体4和21的配体诱导脾脏免疫系统的基因表达

Toll样受体(TLRs)是一组保守的蛋白质,除了在先天免疫和适应性免疫反应的启动和调控中发挥重要作用,还参与病原体识别。目前,已鉴定到若干个识别不同配体的鸡TLRs,在刺激鸡对病原体产生宿主反应中发挥重要作用。然而,通过哪个TLRs对鸡免疫系统进行调节尚未明了。本试验通过分别向试验鸡肌肉注射TLR4和TLR21相应的配体脂多糖(LPS)和CpG寡聚脱氧核苷酸(ODNs),对其刺激鸡免疫反应的动力学特性进行了研究。在注射TLR配体2、6、12和24h时,可在脾脏中检测到细胞因子的相应表达。结果表明,LPS能在试验早期强烈诱导免疫系统基因表达的上调,包括IFN-γ、IL-10和IL-1β。CpG ODNs能促进MHC-Ⅱ、IFN-γ和IL-10的上调。而对CpG ODNs的应答比对LPS的应答略迟。在对LPS的反应中,IFN-α基因的表达显著增加,而在对CpG ODNs的反应中无明显变化。进一步试验将对鸡TLR激活的分子机制或应用TLR激动剂作为疫苗佐剂进行研究。     

猪IFN-γ和CpG基序双因子重组质粒增强亚洲Ⅰ型口蹄疫灭活病毒抗原免疫水平的研究

分析CpG基序与猪IFN-γ基因组合的重组表达质粒对口蹄疫灭活抗原的免疫佐剂效应.以亚洲I型口蹄疫灭活病毒为抗原,与含有猪IFN-γ基因和CpG基序的重组质粒配伍,采用肌肉注射法免疫小鼠,加强免疫后检测口蹄疫特异性抗体和中和性抗体水平、T淋巴细胞增殖反应、体内细胞毒性T细胞杀伤反应以及细胞因子IL-4、IL-6和IFN-γ的分泌水平.发现猪IFN-γ和CpG基序双因子重组质粒相对单一的因子能诱导更强的体液免疫和细胞免疫反应水平,尤其在中和性抗体和抗原特异性CTL反应方面更为明显.猪IFN-γ和CpG基序在诱导小鼠抵抗亚洲I型口蹄疫火活病毒免疫方面具有良好的佐剂效应,其重组质粒可望成为一种有前途的新型免疫佐剂.     

CpG ODN对仔猪淋巴细胞增殖和细胞因子诱生的影响:在体和离体试验

将CpGODN、non CpG ODN分别接种初生仔猪，同时分离仔猪的外周血单核细胞，以CpGODN、non CpG ODN对外周血单核细胞体外培养，分别检测仔猪Th1型细胞因子分泌情况。结果表明，与non CpG ODN和对照组相比，CpG ODN能在体内显著提高仔猪的淋巴细胞白介素-2诱生活性、淋巴细胞增殖、血清中IFN-γ和IL-12水平（P〈0．05），亦能在体外刺激仔猪的外周血单核细胞分泌IFN-γ和IL-12（P〈0．01）。这显示CpG—ODN能显著增强动物的免疫应答能力。     

CpG ODN联合重组乳酸乳球菌鼻内免疫BALB/c小鼠的佐剂效应

本试验初次建立了CpG ODN联合重组乳酸乳球菌滴鼻免疫BALB/c小鼠模型。结果得出CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组血清中抗PRRSV特异性抗体IgG和呼吸道黏膜抗体s-Ig A均高于单独重组菌组(P>0.05)和单独佐剂组(P<0.01),佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组的Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ及黏膜淋巴因子IL-5的活性高于单独抗原组(P>0.05)及单独佐剂组(P<0.01)。试验结果说明CpG ODN作为佐剂与重组菌鼻腔免疫小鼠后,可以提高重组菌诱导的黏膜免疫反应和Th1细胞参与的系统免疫反应,为研究安全有效的重组菌黏膜疫苗奠定了基础。     

CpG ODN对鸡新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应

将3种不同的未甲基化CpGODN分别与新城疫LaSota活疫苗混合后，经滴鼻和点眼免疫鸡，通过检测鸡血清中HI抗体、外周血T淋巴细胞增殖活性、诱导巨噬细胞分泌NO含量，以及刺激外周血淋巴细胞表达IFN-γ、IL-6与IL-1β mRNA量，分析各CpGODN对新城疫LaSota活疫苗免疫效果的影响。结果表明，经2次免疫后，含GTCGTT核心基序的CpG ODN1组，鸡血清平均HI抗体效价最高达8．2log2、淋巴细胞刺激指数达9．836、NO分泌量达35．833μmol／L，分别比疫苗单独免疫组高出2个滴度（P〈0．05）、4．4（P〈0．01）、27．6μmol／L（P〈0．01）；含GACGTT核心基序的CpG ODN2组增强作用不明显．与疫苗单独免疫组无差异；而CpGODN3的免疫刺激活性由于受其侧翼序列的影响，作用明显减弱甚至丧失。对细胞因子的影响，CpGODN3组IFN-γ mRNA表达量稍高于CpG ODN1组，而其余细胞因子均以CpG ODN1组表达水平最高（P〈0．05）。由此证明CpG ODN1能显著增强鸡对新城疫LaSota活疫苗的体液和细胞免疫反应，可以作为高效的免疫增强剂。     

艾美尔球虫子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞炎性细胞因子表达水平

以实时荧光定量PCR方法检测了艾美尔球虫(Eimeria tenella)子孢子体外刺激鸡异嗜白细胞和巨噬细胞炎性细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平。结果发现,与不刺激对照组相比,活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞(4h)和巨噬细胞IL-6mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。灭活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞和巨噬细胞IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-12mRNA表达水平均高于活的E.tenella子孢子,差异显著(P<0.05)。与不刺激对照组相比,灭活的E.tenella子孢子刺激异嗜白细胞IL-6、IL-10、IL-12(2h)和IFN-γ(4h)mRNA表达水平均显著增加(P<0.05),灭活的E.tenella子孢子刺激巨噬细胞IL-6、IL-12和IFN-γmRNA表达水平显著上调(P<0.05)。表明,鸡异嗜白细胞和巨噬细胞受到E.tenella子孢子刺激后炎性细胞因子的显著上调可能与机体清除球虫感染有关。     

猪圆环病毒核酸疫苗pcDNA-PCV-ORF2-ISS的构建及分子佐剂联合免疫研究

用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码CAP蛋白的基因ORF2,同时人工合成一段CpG序列,并设计上下游引物,进行扩增,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建新型核酸疫苗(pcDNA-PCV-ORF2-ISS),并进行了酶切和测序鉴定.用构建的pcDNA-PCV-ORF2-ISS质粒以及pcDNA-PCV-ORF2与5种细胞因子分子佐剂质粒(IL-6/4、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ真核表达质粒)联合对仔猪进行免疫试验.免疫后用间接ELISA法测定猪圆环病毒Ⅱ型特异性抗体IgG,用流式细胞仪测定猪血液CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚类的数量.结果显示,成功构建含CpG免疫刺激序列的猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗;pcDNA-PCV-ORF2-ISS在仔猪免疫实验能诱导细胞免疫并产生特异性抗体(P<0.05);用5种细胞因子分子佐荆质粒与pcDNA-PCV-ORF2疫苗同时免疫能显著提高DNA疫苗的免疫效果(P<0.05).分子佐剂免疫增强效果次序为:IL-6、CpG、IL-6/4、IL-2、IL-4和IFN-γ,表明IL-6和CpG最佳.     

不同CpG ONDs对猪源细胞免疫分子转录水平的影响

为了探究不同CpG ODNs对猪免疫调节作用,设计合成了7条包含CpG单元的寡聚核苷酸。通过体外刺激3种猪源细胞,包括猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)、猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)和猪外周血单核细胞(PBMCs),用荧光定量PCR检测细胞因子转录水平的变化。同时探究了不同CpG ODNs处理过的IPEC-J2的抗病毒能力。不同CpG ODNs都能够使种猪源细胞TLR9和TLR3相关信号通路分子的转录水平升高,促进多种Th类型细胞因子转录水平的升高,促进干扰素和TNF-α和与抗原递呈相关分子转录水平升高。CpG ODNs能够协助细胞抵抗猪流行性腹泻病毒和水疱性口炎病毒的感染,但抗病毒能力存在差异。CpG ODNs可作为一种良好的猪用疫苗佐剂。     

梅山猪血液细胞因子水平的测定与分析

试验利用猪多细胞因子检测试剂盒(Procarta Immunoassay Kits)对35日龄梅山猪血液中部分重要细胞因子(IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12)水平进行测定,分析梅山猪各细胞因子水平间的相互关系,并比较梅山猪和大白猪之间部分重要细胞因子水平的差异。结果表明:健康状态下梅山猪血液中IFN-α、IL-2的水平较高,而IFN-γ、IL-6、IL-10及IL-12水平相对较低;IL-2、IL-6、IL-10水平之间显著相关,存在密切的联系;梅山猪IL-10水平极显著高于大白猪(P0.01),而IL-6水平极显著低于大白猪(P0.01)。试验结果初步解释了地方品种梅山猪与引进品种大白猪抗病力差异的免疫学基础,并为今后梅山猪一般抗病力评价体系的建立和抗病育种工作提供一定的理论依据。     

嗜酸乳杆菌胞外多糖对TGEV感染ST细胞分泌IFN-γ IL-6 IL-8的影响

为研究抗病毒嗜酸乳杆菌菌株的细胞机制,利用嗜酸乳杆菌胞外多糖(EPS)作用于猪睾丸细胞(ST),以MTT法检测其是否抑制猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染,并观察IFN-γ、IL-6、IL-8的mRNA表达水平。本试验分为4组,分别是正常细胞对照组(Control组)、TGEV感染组(TGEV组)、EPS预处理感染TGEV组(EPS+TGEV)组和胞外多糖组(EPS组),在2、4、6、12、24 h时采集细胞样品,通过荧光定量PCR方法检测不同时间点各组细胞中IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA的表达量。结果发现,EPS具有抑制TGEV感染ST细胞的效应;EPS组、TGEV组和EPS+TGEV组IFN-γ、IL-6、IL-8 mRNA表达量较Control组比都相对增加,三种细胞因子随着时间的延长,均呈现出先快速增加后减少回归到正常水平的趋势。EPS+TGEV组在感染2 h时IL-8 mRNA表达量达到最大值,4 h时IL-6、IFN-γmRNA表达量达到最大值,且均出现了叠加效应,相比正常细胞对照组差异极显著(P0.001)。结果表明,EPS对TGEV感染ST细胞有一定的抑制作用,提高了抗TGEV感染初期IFN-γ、IL-6、IL-8 mRNA表达水平。     

CpG-DNA免疫刺激活性研究进展

CpG—DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序(CpG motif)为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxvnucleotides，ODN)和自然界中某些低等生物的基因组DNA。近几年研究证实，CpG基序能在体内诱导强烈的免疫反应，主要包括激活B细胞增殖、分化、分泌白细胞介素-12(IL-12)及其他细胞因子，激活自然杀伤细胞(NK)的裂解活性，分泌     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后IL-17、IL-18和IFN-γ mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)后,对其细胞因子IL-17、IL-18和IFN-γmRNA转录水平的影响,探讨禽呼肠孤病毒感染机制和宿主之间的作用关系。本试验将ARV-S1133感染CEF细胞后,运用荧光定量PCR技术,测定和分析ARV结构蛋白σC和CEF细胞的IL-17、IL-18及IFN-γ的mRNA动态转录水平。结果表明,ARV-S1133感染CEF细胞10h后病毒结构蛋白σC mRNA的相对表达量开始迅速上升,在48h达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF细胞中的IL-17、IL-18和IFN-γmRNA表达量发生变化,IL-17和IFN-γmRNA转录水平在感染早期迅速上调,感染后6h达到第一个峰值,分别上调8.77倍和11.17倍,随后下降,在感染36、48、60h后大幅度上升,且在48h达到峰值,表达量分别为97.19倍和111.58倍。IL-18mRNA转录水平在整个感染过程中表达量较低,在感染6h后微量上调(1.39倍),在感染中后期,其表达量呈下调趋势,感染48h时,IL-18mRNA表达量最低,与对照组相比下调0.19倍;5个不同滴度的ARV病毒感染CEF细胞24h后,3个细胞因子mRNA的表达量与病毒滴度线性相关,IL-17和IFN-γmRNA转录水平与病毒滴度正相关,IL-18mRNA转录水平与病毒滴度负相关。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-17、IL-18、IFN-γ的mRNA转录水平上调,说明IL-17、IL-18、IFN-γ可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

地锦草总黄酮对小鼠免疫功能及细胞因子mRNA表达影响

探讨地锦草总黄酮对小鼠免疫功能及细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-αmRNA表达影响。将小鼠随机分成4组：地锦草总黄酮高剂量组（H组）、中剂量组（M组）、低剂量组（L组）和纯水对照组（C组）,连续灌胃9 d后,检测其单核巨噬细胞吞噬功能、2%绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应、肝脏指数和脾脏指数,并用逆转录酶-聚合酶链式反应的方法检测脾脏IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA表达水平。结果显示,地锦草总黄酮3个剂量组脾脏指数、廓清指数（K）、吞噬指数（α）、24 h足跖增厚值均显著高于C组;M组和H组肝指数显著高于C组（P〈0.01）;3个剂量组均能提高IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA的表达水平,与C组相比,H组最显著。试验结果表明,地锦草总黄酮能有效提高机体的免疫功能及IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-αmRNA表达。     

不结球白菜提取物对肉鸡脾脏IL-2、IL-4及IFN-γ mRNA表达的影响

本研究旨在探讨不结球白菜提取物(NCCE)对肉鸡脾脏细胞因子mRNA表达水平的影响。选取1日龄健康AA肉鸡180只,随机分为6个处理,每个处理3个重复,每个重复10只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础日粮,处理组分别在基础日粮中添加100、300、500、700、900 mg/kg NCCE,试验期为42 d。采用实时荧光定量PCR检测NCCE对肉鸡脾脏组织中白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)及γ-干扰素(IFN-γ)mRNA的相对表达量。结果表明,与对照组相比,300、500、700、900 mg/kg处理组显著提高了鸡脾脏IL-2、IL-4 mRNA表达水平(P0.05);500、700、900 mg/kg处理组显著提高了IFN-γmRNA表达水平(P0.05);与700 mg/kg处理组相比,500 mg/kg处理组IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量具有增加的趋势(P0.05)。NCCE能够诱导肉鸡脾脏IL-2、IL-4及IFN-γmRNA的表达,基础日粮中添加500 mg/kg效果最好。     

猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用研究

为了研究猪IL-2、IL-4和IFN-γ对口蹄疫合成肽疫苗的免疫佐剂效应,将经测定具有生物学活性的猪重组IL-2、IL-4和IFN-γ与口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔猪,检测仔猪抗口蹄疫抗体水平和血清细胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明:制备的IL-2、IL-4和IFN-γ重组蛋白质均有较好的生物学活性,其中IL-2和IFN-γ重组蛋白质均能极显著提高仔猪抗口蹄疫抗体水平(P0.01),而IL-4重组蛋白质抑制口蹄疫抗体的产生(P0.01)。血清细胞因子检测结果发现口蹄疫疫苗+IL-4组的IL-4和IL-10含量均较空白疫苗免疫猪显著升高(P0.05),口蹄疫疫苗+IL-2组及口蹄疫疫苗+IFN-γ组的IFN-γ含量较空白疫苗免疫猪极显著升高(P0.01)。结果提示,重组细胞因子IL-2和IFN-γ分别作为免疫佐剂与口蹄疫疫苗联用,能显著增强机体的体液和细胞免疫应答。     

猪全血中IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立及对猪瘟疫苗的免疫评价

为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。     

感染肺炎支原体绵羊外周血单核细胞细胞因子和ISG15 mRNA表达水平动态观察

探讨绵羊感染肺炎支原体后相关细胞因子和干扰素刺激因子15(ISG15)的变化及其意义。应用Real-time PCR方法检测了18只经人工感染肺炎支原体的巴什拜羔羊和盘羊杂交羔羊的外周血单核细胞中IFN-γ、IL-12和ISG15 mRNA的表达水平。结果:在感染后的第7天与第14天,巴什拜羊ISG15的表达量显著高于盘羊杂交羊和对照组(P<0.05);盘羊杂交羊和巴什拜羊的IFN-γ表达水平显著高于对照组(P<0.05);在感染后的第14天,盘羊杂交羊的IL-12表达水平显著高于巴什拜羊(P<0.01)。证实IFN-γ、IL-12和ISG15在肺炎支原体感染过程中起重要作用,对研究支原体肺炎发病机理及提供免疫治疗有指导意义。     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞细胞因子IL-10、IL-12p40和IFN-γ mRNA转录的影响

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)细胞因子IL-10、IL-12p40和IFN-γ的mRNA转录水平的变化进行了定量分析。结果表明,IL-12p40 mRNA转录从攻毒后3 d开始显著上调(P<0.05),7 d达高峰,14 d开始下降,但仍显著高于对照组(P<0.05),28 d和42 d低于对照组;IL-10 mRNA在3 d显著上调(P<0.05),14 d达到转录高峰(P<0.01),之后逐渐下降,42 d接近对照组水平;IFN-γmRNA转录水平尽管在3 d和28 d时出现2次转录低峰1、4 d和42 d时出现2次高峰,但只在3 d和7 d差异显著(P<0.05)。由此表明,PRRSV和PCV2共感染可导致PAM细胞因子IL-12p40和IL-10 mRNA的转录在感染早期被激活,而IFN-γ mRNA转录则呈较复杂的动态变化,提示PRRSV和PCV2共感染猪PAM的免疫应答、免疫调节和抗感染功能均受到不同程度的影响。     

IL-4受体阻断对小鼠急性感染肝片吸虫后肝脏单核细胞悬液中细胞因子的影响

本研究旨在探索肝片吸虫感染小鼠急性期肝脏单核细胞悬液中细胞因子表达模式及其原因。试验将小鼠分为4组,分别对感染抗体处置组、感染非抗体处置组、抗体处置非感染组和非抗体处置非感染组的肝脏单核细胞培养上清液中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ进行测定;同时也对肝脏中IL-4及IL-12P40 mRNA水平进行荧光定量PCR检测。结果显示,IL-4和IL-5的表达模式相似。在非感染状态下,无论是否进行抗体处置,两者都处于较低表达水平。在感染状态下,两者在非抗体处置小鼠中的表达显著高于抗体处置组(P<0.05)。IL-13与IL-4及IL-5的表达差异在于感染并用抗体处置后,小鼠肝脏单核细胞中的IL-13仍有较高水平表达。IFN-γ的表达量在感染后有所增加,但在有无抗体处理间无显著差异(P>0.05)。mRNA检测结果显示,在非感染状态下,抗体处置后的IL-4 mRNA水平显著低于非抗体处置组(P<0.05)。感染后非抗体处置组小鼠中IL-4 mRNA水平极显著高于抗体处置组(P<0.01),同时也极显著高于非感染非抗体处置组(P<0.01)。IL-12P40 mRNA的水平在感染状态下,抗体处置组的IL-12P40 mRNA虽较非抗体处置组低,但无显著差异(P>0.05)。但感染后非抗体处置组的IL-12P40 mRNA水平均极显著高于感染组抗体处置和非抗体处置组(P<0.01)。本试验结果表明,IL-4Rα对肝片吸虫感染急性期IL-5和IL-4的表达极其重要,但对IL-13及IFN-γ的影响较小。     

黄芪多糖对犬脾淋巴细胞细胞因子mRNA表达的影响

探讨黄芪多糖(APS)对犬脾淋巴细胞细胞因子mRNA表达的影响。10μg/mL APS作用于ConA或LPS刺激的犬脾淋巴细胞,RT-PCR方法检测相关细胞因子mRNA表达。结果表明,APS对IL-2、IFN-γ和TNF-αmRNA表达有显著增强作用,促进IL-2和IFN-γmRNA表达的效果显著优于ConA,而对IL-4 mRNA表达没有明显影响;在上述相关细胞因子mRNA表达抑制时,APS能使其表达显著提高。结论:APS通过对犬脾脏T淋巴细胞Th1型和Th2型细胞因子mRNA表达的整体调节来促进细胞免疫。