猪IL-2、IL-12p40和IFN-γ SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪Th1型细胞因子IL-2、IL-12p40、IFN-γ以及管家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-2、IL-12p40、IFN-γ及β-actin的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到100拷贝/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3.5%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中IL-2、IL-12p40和IFN-γ mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,所建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。     

鸭IL-2 mRNA SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

鸭是一种与人类关系十分密切的水禽,对其相关基因表达水平的定量分析,为进一步了解各基因功能及其与生产、抗病能力的关系具有十分重要的应用价值。细胞因子与某些疾病的发生发展密切相关,故对细胞因子及其受体的检测越来越受到重视实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-FQ-PCR)技术是RNA定量领域     

猪IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨PRRSV感染后机体的体液免疫应答、从分子水平深入研究PRRSV的免疫机制,本研究针对Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-4、IL-6、IL-10及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。该方法线性关系好,各种细胞因子及β-actin标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染仔猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-4、IL-6和IL-10mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的real-timePCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪Th2型细胞因子的检测及定量分析。     

鸭IL-2mRNA SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

鸭是一种与人类关系十分密切的水禽,对其相关基因表达水平的定量分析,为进一步了解各基因功能及其与生产、抗病能力的关系具有十分重要的应用价值.细胞因子与某些疾病的发生发展密切相关,故对细胞因子及其受体的检测越来越受到重视.实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-FQ-PCR)技术是RNA定量领域的创新,该技术为组织或细胞中mRNA检测提供了一种敏感性和准确性均很高、重复性好的试验方法,减少了普通PCR反应中易产生污染等弊端,并可进行高通量操作.该技术已成为目前检测细胞因子的标准方法之一[1-2].     

猪IL-10 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测方法的建立

白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子.能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10.为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL 10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、βactin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2△△ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法.该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2％,批间变异系数小于3％;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7％、97.8％.综上所述,该方法可以用于猪IL-10 mRNA水平的表达分析.     

猪IL-10 SYBR Green I Real-time PCR检测方法的建立

白介素-10(IL-10)是一种具有免疫抑制作用的多能细胞因子。能够引发猪免疫抑制效应的多种病毒在感染宿主时均伴随有明显的IL-10上调,其中就包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),然而并不是所有的PRRSV毒株都能上调IL-10。为了详细探讨PRRSV免疫抑制与IL-10上调之间的关系以及PRRSV感染上调IL-10的具体分子机制,本研究针对猪IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建了各自含有IL-10、β-actin引物扩增序列的重组质粒为阳性标准品,建立了以2-△△Ct为基础的SYBR GreenⅠrealtime PCR检测方法。该方法线性关系良好;敏感性高,两种基因的检测下限均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性良好,批内变异系数小于2%,批间变异系数小于3%;目的基因及内参基因的扩增效率较高,分别为92.7%、97.8%。综上所述,该方法可以用于猪IL-10mRNA水平的表达分析。     

猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×109~8.80×101 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×101 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。     

猪IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ireal-time PCR检测方法的建立及应用

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白，本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因．将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中，构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞，得到重组穿梭质粒reBacmid—NP；通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。     

寨卡病毒SYBR GreenⅠreal-time PCR方法的建立及应用

为建立一种针对寨卡病毒的快速诊断方法,本研究根据寨卡病毒的3’端保守基因序列,设计合成1对引物,建立了检测寨卡病毒的荧光定量PCR方法。结果显示:所建立的检测方法的Ct值与标准品在1.41×10^1~1.41×10^10^ copies/μL具有良好的线性关系,相关性为1,斜率为-3.502;灵敏性结果显示,该方法的检测限度为1.41×10^1 copies/μL,是普通PCR的10000倍;特异性结果显示,对CHIKV、DENV和JEV无特异性扩增,特异性强;重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于1%,重复性好。本研究建立的SYBR Green I real-time PCR检测方法,可用于寨卡病毒感染的快速诊断。     

猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

猪圆环病毒2型(PCV2)为圆环病毒科,圆环病毒属成员,是一种单股负链环状的DNA病毒,无囊膜,病毒粒子直径为17 nm.临床上对于该病毒相关疾病的诊断主要根据其临床症状,但由于猪圆环病毒同猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等引起的疾病临床症状相似,临床症状和病理变化只能作为初步诊断的依据,难以确诊.     

牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

猪博卡病毒1/2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。     

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL~5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。     

犬腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立良好的犬腺病毒检测方法,参考GenBank中犬腺病毒毒株(GenBank登录号:U77082.1)的E3基因,设计并合成了一对特异性引物。扩增的目的片段与pMD19-T载体相连接构建重组质粒,以该重组质粒为模板建立特异性好、灵敏度高且可快速检测犬腺病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。经特异性方法验证,在常见的五种犬病毒病中,本方法只能检测出犬腺病毒存在。敏感性试验结果表明,本方法的灵敏性较普通PCR方法高出100倍。重复性试验结果的变异系数均不高于0.95%。本方法的建立可为犬腺病毒的检测提供技术支持。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)核酸的荧光PCR方法,试验根据GenBank中ASFV的p72基因和PCV2的ORF1基因序列,分别设计特异性引物,通过对加样体系和扩增程序的优化,建立了检测ASFV和PCV2的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价,最后对收集的临床样品进行检测。结果表明,最终确立的20μL反应体系中各引物最佳添加量为：F1 0.7μL、R1 1.0μL、F2 0.8μL和R2 1.5μL;优化后的扩增反应程序为：95℃预变性3 min; 94℃变性5 s, 54℃退火20 s (此处收集荧光),40个循环。该方法具有很好的特异性,不与其他常见猪病原体发生交叉反应。检测ASFV和PCV2的灵敏度分别可达5.6 copies/μL和3.2 copies/μL,T_m值的批内和批间变异系数均不高于1.0%,对14份临床样品的检测结果与参比方法一致。本研究所建立ASFV和PCV的双重SYBR GreenⅠ荧光PCR方法敏感性高,特异性好,可用于临床2种疾病的快速检测。     

猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快捷、特异、敏感的检测猪圆环病毒3型(PCV3)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,根据GenBank公布的PCV3全基因组序列,在rep基因高度同源保守区设计并合成1对特异性引物,从阳性病料DNA中PCR扩增PCV3rep基因。PCR产物克隆入pMD~18-T载体中,构建重组质粒(pMD18-PCV3rep),转化到大肠杆菌DH-5α中。经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品模板,经过反应条件优化,建立了检测PCV3的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法线性关系良好,R2=0.998 2;仅PCV3阳性病料出现特异性扩增,而与另外6种病原无交叉反应;该方法检测下限为21.9copies/μL;批间及批内变异系数分别为0.394%~0.935%和0.112%~0.775%,均小于1%。经临床应用证实,该方法具有良好地特异性、敏感性和稳定性,为PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术支持。     

小鹅瘟病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增GPV VP1基因173 bp的基因片段,克隆到PMD18-T载体上,将纯化后的质粒做为模板,建立扩增反应的标准曲线,最终建立了小鹅瘟病毒(GPV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏性高,可检测2×101拷贝/μL的模板量;特异性好,与鹅副黏病毒、鹅流感病毒、鹅源鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、曲霉菌均不发生交叉反应。建立的GPV荧光定量PCR具有特异性好、敏感度高、检测时间短、结果重复性好等优点,可用于小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查。