一株高效降解玉米赤霉烯酮的耐酸耐高温枯草芽孢杆菌的研究

为寻求更高效、实用的生物脱毒制剂,提高其应用范围,通过采集酸性、高温的温泉环境样品,筛选获得1株高效降解玉米赤霉烯酮(ZEN)的细菌菌株Y-33,并对该菌株生长和降解特性进行分析。结果表明,菌株Y-33在50℃、pH值5.0条件下孵育36 h,菌液对2 μg·mL^-1 ZEN的降解率高达93.79%,对20 μg·mL^-1 ZEN的降解率也达82.40%。从形态、生理生化特性及16S rDNA序列对菌株Y-33进行分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株发酵上清液在28℃条件下对ZEN降解率为62.02%。金属离子Mn²⁺能明显增强菌株Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率达81.17%,而Zn²⁺严重抑制了Y-33发酵上清液对ZEN的降解能力,降解率仅为5.42%。本研究结果为ZEN解毒菌剂的开发与应用奠定了理论基础。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达

玉米赤霉烯酮(ZEN)是具有雌激素作用的次生代谢产物,可以被来源于Gliocladium roseum的内酯水解酶降解为无毒物质。为了实现玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6在枯草芽孢杆菌中的表达,获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,本研究采用一步克隆及重叠延伸PCR的方法构建了单启动子和包含Hpa Ⅱ和P43双启动子的表达质粒,将质粒转化到枯草芽孢杆菌中,获得重组菌株168/pMA5-zlhy-6和168/pMA5-P43-zlhy。然后构建了重组整合载体amy-p43-zlhy,将zlhy-6基因整合到枯草芽孢杆菌168的基因组中。通过Cre/lox系统敲除抗生素抗性基因,获得整合了P43-zlhy表达盒的食品级重组枯草芽孢杆菌BZ-zlhy。将构建的3个重组菌株在37℃、pH值7.5条件下培养36 h,结果显示,双启动子表达载体重组菌株的最高酶活性为2.2 U·mL^-1,是单启动子菌株的1.2倍。双启动子重组菌株表达的降解酶对ZEN(4 μg·mL ^-1,30 min)的降解率为65.1%。重组菌株枯草芽孢杆菌BZ-zlhy表达水平最低(0.4 U·mL^-1)。本研究实现了玉米赤霉烯酮降解酶在枯草芽孢杆菌中表达,同时构建了不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌,为玉米赤霉烯酮降解酶的工业化生产奠定了基础,也为解决粮食储藏和饲料生产中的ZEN污染提供了思路。     

高速液相色谱法测定玉米中玉米赤霉烯酮（ZEA）残留

本文介绍了一种快速高效液相色谱法定量测定玉米中真菌毒素玉米赤霉烯酮的方法。样品用甲醇,乙腈,水混合液提取,提取液经液－液分配萃取,硅镁吸附剂柱层析纯化后,用反相柱ＯＤＳ－Ｈｙｐｅｒｓｉｌ分离,流动相为甲醇或者甲醇与水混合液。     

玉米赤霉烯酮化学发光免疫分析检测系统设计

为了保障粮食安全,该研究根据玉米赤霉烯酮抗原抗体反应,以及辣根过氧化物酶催化鲁米诺过氧化氢反应产生化学发光,设计一款应用于粮食行业的玉米赤霉烯酮检测系统。采用侧窗型高精度光电倍增管MD983以及16位AD转换芯片,实现化学发光强度信号的准确测量;步进电机驱动旋转精密转台,通过优化步进电机的S型脉冲驱动控制曲线参数,完成转台的高精度定位控制,实现光电倍增管的测试窗口和化学发光孔精确对准;通过精密直线导轨滑台驱动加样器的进给,实现反应液微米量级的准确微量加样。利用竞争性免疫分析方法,使得赤霉烯酮毒素为0 μg/kg情况下,化学发光反应具有最大发光量,解决真菌毒素低浓度情况下的检测精度难题。经过试验验证,系统检出限为0.1 μg/kg,样品加标回收率在90%以上,标准曲线决定系数为0.996 5,系统检测玉米赤霉烯酮的线性范围为0~60 μg/kg。研究表明建立的玉米赤霉烯酮检测系统满足国家粮食行业对于粮食中玉米赤霉烯酮含量检测要求,为真菌毒素检测仪器的国产化提供参考。     

玉米赤霉烯酮降解酶基因（ZEN-jjm）的克隆、表达及活性分析

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是世界上污染范围最广泛的一种镰刀霉毒素,能导致人或动物不孕、流产等症状,损害内脏器官并促进癌细胞的生长.本文通过设计1对特异性引物,从粉红螺旋聚孢霉(Gliocladium roseum)中克隆获得大小为795 bp的DNA片段(ZEN-jjm),通过构建E. coil原核表达载体进行表达.经HPLC检测证实,IPTG诱导后的细胞裂解上清能在3 h内完全降解液体中1μg/mL的ZEN.序列分析结果表明ZEN-jjm与zhd101存在9个碱基的差异,ZEN-jjm编码的ZEN降解酶与文献报道的乳糖水解酶存在3个氨基酸的差异,但ZEN毒素降解实验证实二者活性相似.     

拉曼光谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮

为提高激光拉曼光谱技术对不同霉变程度玉米中的黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)检测的准确率,本试验以6个不同霉变等级的玉米样品为研究对象进行拉曼光谱检测.首先采用迭代多项式拟合基线校正方法对原始拉曼光谱进行基线校正,去除荧光背景;然后采用多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)和高斯-洛伦兹混...     

玉米赤霉烯酮的高灵敏时间分辨荧光免疫分析

采用时间分辨荧光技术建立高灵敏的玉米赤霉烯酮（ZEN）间接竞争免疫分析法（ZEN-TRFIA）。以玉米赤霉烯酮人工抗原（ZEN-BSA）包被96孔板为固相抗原，与ZEN标准或样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN的单抗；用稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪。该方法的灵敏度为0.01 μg/L（10ppt），测量范围为0.01-20 μg/L，批内和批间变异分别为7.2%和14.6%，平均回收率为94.4%，与玉米赤霉醇（ZER）的交叉反应率为15.16%。7条不同时间进行的ZEN-TRFIA的效应点值ED20、ED50、ED80分别为0.156±0.035 μg/L、0.634±0.091 μg/L和2.595±0.274 μg/L。试剂盒4℃保质期超过6个月。研究表明，ZEN-TRFIA是目前报导的ZEN检测中较灵敏的方法，该分析方法稳定性好，货架期符合要求，可测范围宽，具有很好的应用前景。     

外包木霉内含芽孢杆菌颗粒生物有机肥研制及其促生效应

  目的  利用造粒喷涂技术,研制了外包木霉菌内含芽孢杆菌（SQR9）的颗粒复合菌生物有机肥,以辣椒为供试作物,利用盆栽试验,研究了新型生物有机肥对辣椒植株株高、茎粗、叶绿素等农艺性状的影响。  方法  首先利用圆盘造粒机将有机肥、芽孢杆菌和适量粘合剂制成颗粒芽孢杆菌生物有机肥,随后,再将真菌木霉孢子喷涂颗粒表面,利用第一次添加的粘结剂形成外包真菌孢子膜的新型颗粒复合菌生物有机肥。  结果  货架期试验结果表明,颗粒肥料中木霉菌比粉状肥料存活能力更强,在储存60天后,新型颗粒复合菌生物有机肥中木霉菌含量大于2 × 107 cfu g?1,芽孢杆菌数量大于1.2 × 108 cfu g?1。盆栽试验结果表明,在种植47天后,施用新型颗粒复合菌生物有机肥的辣椒植株在株高、茎粗、叶绿素、鲜重和干重方面均高于其他处理（含SQR9颗粒生物有机肥、含SQR9和木霉菌的粉状生物有机肥、含木霉菌颗粒生物有机肥和含SQR9和木霉菌的颗粒生物有机肥处理）,表明了该新型颗粒复合菌生物有机肥对辣椒具有明显的促生效果。  结论  相比于单菌和其他工艺研制的复合菌生物有机肥,外包木霉真菌内含芽孢杆菌新型颗粒复合菌生物有机肥能够充分发挥木霉真菌和芽孢杆菌的促生功能,有效增强复合菌生物有机肥的促生效果。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

两株芽孢杆菌对茶用菊红心菊生长和品质的影响

为探讨从不同品种菊花根际土壤中分离的两株芽孢杆菌对茶用菊生长和品质的影响,以茶用菊红心菊为试验材料,研究对照(CK)、接种解淀粉芽孢杆菌处理(Ba)、接种枯草芽孢杆菌处理(Bs)、接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合处理(Ba+Bs)对茶用菊红心菊各生育期生理指标的影响。结果表明,苗期菌剂对各生理指标的促生效果显著高于生长期和花期;花期时,菌剂接种处理均不同程度地促进了茶用菊红心菊收获时品质和产量的提高,其中绿原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎宁酸含量与CK相比平均提高20%左右,且三组接种菌剂处理之间无显著差异,而Ba+Bs处理后红心菊的黄酮含量最高,比CK提高15.64%,同时该处理红心菊的估产量也最高,比CK、Ba和Bs分别提高了152.00%、64.12%和33.61%。综上所述,在茶用菊苗期栽培土壤中混合接种解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(Ba+Bs)可以显著提高红心菊外观品质、花期产量以及茶用品质。本研究结果为今后茶用菊功能微生物有机肥研发奠定了良好的基础。     

解淀粉芽孢杆菌41B-1R对棉花黄萎病的防效研究

棉花黄萎病严重危害棉花生产,尚无有效的控制方法。为提高棉花对黄萎病的抗性,本研究将从棉花根系中分离的对棉花黄萎病菌有较好抗性的内生细菌解淀粉芽孢杆菌41B-1R菌株添加到育苗基质中,培育苏棉22和中棉所41 2个棉花品种的幼苗,并评价生物育苗基质对棉花生长及抗黄萎病的效应。结果表明,育苗基质适合作为41B-1R的保存载体;添加生防菌41B-1R的育苗基质对棉花幼苗生长无不良影响;41B-1R能稳定地定殖于棉花幼苗根系内部。育苗后移栽,可有效减少非落叶型棉花黄萎病菌V1070在苏棉22和中棉所41幼苗根部的定殖,显著提高棉苗对黄萎病的抗性,防治效果分别达到46.7%和28.6%。本研究表明,用添加41B-1R菌株的育苗基质育苗可以有效降低棉花黄萎病的危害,为棉花黄萎病的防治提供了新途径。     

普施特降解菌Bacillus sp.zx2和zx7生长及降解特性

芽孢杆菌zx2和zx7是普施特高效降解菌,研究其生长和降解特性旨在为普施特污染土壤的生物修复提供科学依据。采用瓶培养法,对芽孢杆菌zx2和zx7的生长特性及单菌和复合菌对普施特的降解特性进行了研究。结果表明,zx2和zx7均可在普施特初始浓度≤200mg·L-1的无机盐培养液中生长良好,zx2在温度25～35℃和pH4.0～7.0时生长良好,而zx7适宜在温度30～35℃和pH5.0～8.0时生长,可见在适应性上二者互补。在最佳条件（温度32℃、pH6.0和普施特初始浓度为200mg·L-1）下,zx2和zx7在无机盐培养液中对普施特降解动态均符合阻滞动力学,半衰期分别为3.8d和2.8d,培养6d时普施特降解率分别为85.81%和90.27%。在培养过程中,zx2的pH是降低的,而zx7的pH基本不变,可初步表明二者降解机理不同;zx2和zx7复合菌（1∶1）对普施特降解率比单菌低,为82.70%,这可能是因为zx2或zx7降解普施特的过程中利用了对方产生的降解产物。     

解淀粉芽孢杆菌W48 对大蒜产量品质 及土壤质量提升效果研究

为明确微生物菌剂改善大蒜产地环境、提升产量品质的效果,利用常规施肥结合解淀粉芽孢杆菌W48发酵液进行大蒜田土壤处理,测定大蒜产量和品质相关指标,监测土壤理化性质及生物转化相关酶活性变化,定量分析菌剂处理后土壤和大蒜中邻苯二甲酸酯类塑化剂（PAEs）含量差异。结果表明,W48菌株具有分泌吲哚乙酸的能力,同时具备溶磷和产铁载体的潜力。施用W48微生物菌剂显著增加了植物根际土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量,改善根际区域营养环境,提高了土壤碱性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶等生物转化相关酶活性,提高了土壤氮、磷元素利用效率;与对照相比,微生物菌剂处理的小区大蒜增产10%,可溶性糖和维生素C含量等品质指标均有提高,其中可溶性糖显著增加了30%;邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）是土壤和大蒜中PAEs的主要检出类型,土壤中的平均浓度分别达到1874.05和337.12μg/kg,大蒜中几种PAEs残留量普遍较高,DBP最高为666.57μg/kg,其次为邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）409.93μg/kg和邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）433.65μg/kg。菌剂对PA...     

Degradation of benzoate via benzoyl-coenzyme A and gentisate by Bacillus stearothermophilus PK1, and purification of gentisate 1,2-dioxygenase

The thermophilic Bacillus stearothermophilus PK1 utilized benzoate, 3-hydroxybenzoate, and gentisate as sole source of carbon and energy. 2- and 4-Hydroxybenzoate, 2,3- and 3,4-dihydroxybenzoate, and catechol did not support growth. Degradation of benzoate proceeded via benzoyl-coenzyme A (benzoyl-CoA) and gentisate. The inducible benzoyl-CoA ligase converted benzoate but not 3-hydroxybenzoate to its coenzyme A thioester. Gentisate 1,2-dioxygenase from B. stearothermophilus PK1 was purified to homogeneity. The enzyme is presumed to be a homohexamer with a subunit molecular mass of 40 kDa. It showed maximal activity at 65–70°C. After incubation for 80 min at 65°C, 50% of the original activity was lost. Gentisate 1,2-dioxygenase activity from strain PK1 was strictly dependent on exogenously added Fe²⁺, and it was inhibited by metal-chelating agents, indicating an essential role of Fe²⁺ in catalysis.Dedicated to Professor J. C. G. Ottow on the occasion of his 60th birthday     

添加巨大芽孢杆菌与胶质芽孢杆菌对土壤DTPA提取态Cd的影响

采用短期和长期恒温培养的方法,研究巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌及两菌混合液对土壤DTPA提取态Cd的影响.结果表明,短期试验中巨大芽孢杆菌对土壤Cd有一定的活化作用,不同Cd污染水平条件下,巨大芽孢杆菌使土壤DTPA提取态Cd增加比例在3.8％～24.4％之间,其中50 mg/kg CdCO3污染水平条件下,巨大芽孢杆菌加菌量为2 ml时活化效果最好,而胶质芽孢杆菌和混合菌则对土壤Cd无显著影响或有一定的钝化作用.长期培养试验中,巨大芽孢杆菌也表现出了对土壤Cd的活化作用,未添加Cd条件下,巨大芽孢杆菌加菌量为10,20 ml时,土壤DTPA提取态Cd较对照分别增加了44.0％,28.9％,而胶质芽孢杆菌和混合菌对土壤Cd无显著影响或有一定的钝化作用.