双夹心ELISA检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体方法的建立

用胸膜肺炎放线杆菌血清2型(1536)菌液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后免疫大白兔,制备兔高免血清,提纯抗体,建立检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的双夹心ELISA方法.方阵滴定确定最佳反应条件:包被纯化的兔抗App血清2型抗体为9.375 μg/mL,抗原稀释度为1∶1 600,HRP-兔抗猪IgG稀释度为1∶20 000.特异性与敏感性试验结果表明,双夹心ELISA方法特异性好、敏感性高,与猪O型口蹄疫、猪传染性胃肠炎、蓝耳病等阳性血清以及App其他血清型阳性血清无交叉反应.检测样品结果与阻断ELISA比较,其相符率为99.54%,表明双夹心ELISA可用于猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的检测.     

仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15min。7S抗原蛋白的最适包被质量浓度为2.5μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间25min。11S和7S抗原蛋白间接ELISA检测方法的批内、批间变异系数均小于10%,重复性较好,灵敏度较高。【结论】建立了仔猪血清大豆抗原蛋白抗体间接ELISA检测方法,该法具有很强的特异性和敏感性,可用于大豆抗原蛋白11S、7S过敏反应的临床诊断。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用特异性好的鼠源抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)单克隆抗体为捕获抗体,兔源多克隆抗体为检测抗体,建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳反应条件为:抗PEDV单克隆抗体E1包被质量浓度4.40μg·mL~(-1),37℃包被2h,采用5%BSA封闭液封闭1h,兔抗PEDV抗体工作质量浓度为5.91μg·mL~(-1),酶标二抗稀释度为1∶2000,以OD450nm≥0.381作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应。敏感度可达30μg·mL~(-1)(5×103.12);重复性变异系数小于10%。采用该方法和RT-PCR方法同时检测临床样品42份,阳性样品符合率为92.30%,表明建立的PEDV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高和方便快捷等优点,可用于PEDV快速检测。     

ETEC菌毛蛋白K99抗体PPA-ELISA检测 方法的建立及初步应用

以纯化的大肠埃希菌K99菌毛蛋白为包被抗原,建立检测大肠埃希氏菌K99 Ig G抗体的间接ELISA方法。确定间接ELISA的最适反应条件,即抗原包被的ELISA板4℃过夜,最适抗原包被浓度为4.94μg·m L-1,兔抗体稀释倍数为1:50,猪抗体稀释倍数为1:200,确定最佳封闭液为100 g·L-1脱脂奶粉,最佳封闭时间为0.5 h,血清反应时间为1 h,二抗最适浓度梯度为1:2000,反应时间为37℃0.5 h,底物室温反应时间为37℃10 min,阴阳性临界值兔血清为0.25、猪血清为0.35。试验证实该间接PPA-ELISA方法的特异性强、敏感性高、重复性好,可以为疫苗效力检验和流行病学调查提供参考方法。     

山羊血清TG含量BA-ELISA检测法的建立

作者建立的检测山羊血清中甲状腺球蛋白(Thyroglobulin,TG)的BA-ELISA法,其最适条件是:兔抗山羊TG IgG包被浓度为5.88μg/ml,包被时间37℃3h,待测血清稀释度1:16,保温时间1h,生物素化兔抗山羊TG IgG浓度5.8μg/ml,感作时间1h;酶标亲和素浓度0.5μg/ml,感作时间30min,底物显色时间20min。制备的标准曲线在3.625—116ng/ml范围内线性关系良好,最小检出量为3.625ng/ml。     

检测传染性支气管炎抗体NP-ELISA方法的建立

【研究目的】建立可在临床上检测鸡传染性支气管炎抗体的检测IBV抗体的间接ELISA方法;【方法】以表达的重组IBVNP蛋白为包被抗原,将之包被于聚苯乙烯酶标板上,以封闭液进行封闭,然后加待检血清在37℃作用1h,洗涤后加酶标兔抗鸡IgG抗体,在37℃作用1h,加底物显色,终止反应后测定OD值;【结果】抗原包被浓度为1.45μg/ml,待检血清最佳稀释度为1:40,酶标二抗最佳工作浓度为1:1000,确定阳性判定标准为OD450≥0.314。NP-ELISA与AIVH9、H5、H7、IBD、ND、EDS76的标准阳性血清不发生交叉反应,具有良好的特异性;【结论】NP-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好、方便快速的特点,可用于临床IB抗体的检测。     

应用间接竞争ELISA检测山羊痘抗体方法的建立

[目的]为山羊痘疫苗接种山羊后产生的抗体效价检测和山羊痘的诊断奠定基础。[方法]采用Vero-E6传代细胞分离山羊痘病毒抗原,建立检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA方法。[结果]检测山羊痘抗体的间接竞争ELISA的最佳工作条件：最佳抗原包被浓度为1μg/ml,兔抗高免血清最佳稀释度为1∶16 000,待检血清的工作浓度为1∶400,阳性血清的临界值为45.19%,阴性血清的临界值为38.89%。用该试验建立的ELISA方法检测3 000份接种山羊痘疫苗的山羊血清,阳性检出率为83.33%,琼脂扩散试验检出率为77.33%,竞争抑制ELISA方法较琼脂扩散试验方法敏感。[结论]该方法具有特异性高、快速、敏感等特点,适合检测山羊痘抗体。     

猪瘟病毒结构蛋白E0抗体间接ELISA检测方法的建立及优化

为建立一种经济、可靠的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,采用间接ELISA(E0-ELISA)方法,以在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组蛋白E0为包被原,优化反应条件。结果显示,优化后的E0-ELISA在包被原1.0μg/mL质量浓度下37℃包被1 h效果最佳,最佳封闭条件为5%脱脂奶粉溶液37℃作用2 h,待检血清以1∶100稀释后37℃作用60 min效果最佳,二抗以1∶5 000稀释后37℃孵育45 min效果最佳。当OD_(450)0.370时,判断为猪血清CSFV抗体阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为1.99%～7.69%和2.16%～9.23%,表明该方法具有良好的稳定性;E0-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清时结果均为阴性;当CSFV阳性血清稀释至1∶640时结果仍为阳性,表明该检测方法具有良好的敏感性;与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒相比,E0-ELISA检测符合率为92.00%,敏感性为97.86%,特异性为78.33%。综上,成功建立一种经济、稳定、特异性好和敏感性高的CSFV血清抗体间接ELISA检测方法。     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

采用超声裂解副猪嗜血杆菌分离株5型菌体上清作为包被抗原,初步建立副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。通过棋盘滴定法筛选确定最佳反应条件:抗原包被浓度50mg/L,37℃作用2h后4℃过夜包被,血清的稀释度为1∶320,抗原抗体反应时间为50min,酶标二抗稀释度为1∶12 000,作用时间为30min,底物显色时间为15min。经特异性、敏感性和符合性试验检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性高,可用于副猪嗜血杆菌的检疫和流行病学调查。     

检测鸭肿头败血症病毒的间接夹心ELISA的建立及应用

为了快速诊断和检测鸭肿头败血症病毒抗原,用分离自典型鸭肿头败血症的XD株病毒,制备鸭抗XD IgG、兔抗XD IgG,建立了检测鸭肿头败血症病毒(DSHSV)抗原的间接夹心ELISA法。试验的最佳条件为:抗体包被量为8μg/mL,封闭液为0.5%明胶,抗原孵育条件为37℃1.5 h,兔抗XD病毒IgG浓度5μg/mL,酶标羊抗兔抗抗体浓度为1∶2000,洗涤液为0.02 mol/LpH7.2 PBS。阴阳性结果判定的临界OD值为0.412。重复性试验显示变异系数小于10%。建立的间接夹心ELISA法不与鸭肿头败血症阴性抗原、鸭大肠杆菌抗原、鸭瘟抗原、鸭肝炎病毒抗原呈现交叉反应。敏感性比琼脂扩散实验高1280倍。包被的酶标板在4℃至少可以保存3周。用此方法对人工感染鸭组织脏器中鸭肿头败血症病毒检测结果显示,心、肝、肺、肾检出率最高,脑、脾、胰次之。     

快速检测黄瓜细菌性角斑病菌的间接ELISA法优化

采用黄瓜细菌性角斑病菌作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立较优黄瓜细菌性角斑病菌间接酶联免疫吸附分析(ELISA)检测方法。通过对抗原包被浓度和抗体稀释浓度、封闭液和封闭时间、抗体温育时间等的优化,确定ELISA法最低检测限。结果表明:抗原的较优包被浓度为106cfu·mL-1,抗体的较优工作浓度为1∶4000,以5%胎牛血清作为封闭液,在37℃下封闭1.5h,加入抗体温育1.5h是间接ELISA法的较优反应条件,方法的检测限为105cfu·mL-1。对田间采集的病叶进行检测表明,该方法可准确检测出黄瓜细菌性角斑病菌,可用于田间黄瓜细菌性角斑病的快速诊断。     

猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法的建立

实验通过纯化猪附红细胞体后免疫小鼠及家兔制备阳性血清,建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法.实验结果表明,以鼠阳性血清1:200稀释后作为捕获抗体,4℃包被过夜,1%明胶溶液37℃封闭1 h,兔阳性血清1:400稀释后作为检测抗体,辣根过氧化物酶标羊抗兔Igc抗体h:8000稀释,37℃显色10min为最佳反应条件.同时进行特异性、敏感性、重复性实验.该方法对猪附红细胞体最低检出量为3.812μg·mL-1,具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望作为群体检测方法.     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为:σB蛋白包被浓度为12.5μg·mL~(-1);σC蛋白包被浓度为6.25μg·mL~(-1);封闭液为15%FBS;血清稀释度为1∶80;酶标二抗稀释度为1∶400;底物37℃显色5min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较,符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。     

酶标胶固素免疫测定的建立

本文报道了一种新的酶免疫技术——酶标胶固素免疫测定(EKIA)。用猪血清白蛋白(SSA)包被微量滴定板后,加入适当稀释度的兔抗SSA血清、马血清(补体)和酶标胶固素(HRP-K)各50μl,于37℃下反应2小时。洗涤后加入底物显色,即可用分光光度计测定反应结果。本法操作简单、快速、灵敏度高,能检出兔抗SSA的IgG_(0.52)μg/ml;重复性较好,变异系数为7.46-16.67％之间;特异性强,能为相应抗原和EDTA所阻断;具有通用性,适用于人、猪、豚鼠、免、大鼠和鸡抗体的免疫检测。     

间接ELISA检测小鹅瘟抗体反应条件的选择

通过方阵法对间接ELISA抗原、抗体反应浓度进行筛选,再运用正交试验对不同的包被液、封闭液、底物进行比较和选择,最后对酶进行选择,最终确定运用ELISA法测定小鹅瘟抗体的最佳反应条件。即抗原最佳浓度为37.00μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶200,包被液为0.1 mol/L碳酸盐缓冲液,4℃包被12 h,封闭液为10%犊牛血清的PBS溶液,使用羊抗兔IgG酶标二抗,底物为联苯二胺(OPD)。     

检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD4500.345 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。