山东石榴品种对枝条干腐病的抗性评价及其病原菌鉴定

为明确山东省主要石榴品种对枝条干腐病的抗性及引起枝条干腐病的病原菌种类,本研究对山东省枣庄市的20个主要石榴品种进行田间抗性评价。通过组织分离法对病原菌进行分离,利用柯赫氏法则验证其致病性,并通过显微形态特征观察及分子生物学分析开展病原菌鉴定。结合形态学、致病性测定和分子生物学分析结果,将石榴枝条干腐病病原菌鉴定为单间座壳菌(Diaporthe eres)。抗性评价结果显示,白皮酸、碧榴表现为近免疫;大青皮、秋艳、岗榴1号、大马牙、峄城三白、冰糖籽、黑美人表现为抗病;枣庄玛瑙、墨石榴、九洲红、青皮软籽、黄金榴、枣庄软仁表现为中抗;冠榴、谢花甜、红皮马牙表现为感病;大红袍和泰山红表现为高感。筛选得到的近免疫、抗病品种可作为石榴抗性育种和种质资源改良提供研究材料。本研究结果为山东石榴枝条干腐病的抗病机理研究和系统性防控提供了参考。     

长三角地区粳稻种质的稻瘟病抗性基因鉴定及其抗性评价

已克隆的抗稻瘟病基因Pi9、Pib、Pi5、Pita、Pi2、Pikh、Pikm和Pigm对稻瘟病菌表现广谱抗性,这些基因已广泛应用于水稻抗稻瘟病育种.为了明确长三角地区粳稻的抗稻瘟病基因分布及其抗性表现,利用上述8个抗病基因的功能标记对52份粳稻种质进行抗病基因检测.同时,利用江苏省2019年稻瘟病菌代表菌株2019...     

转基因抗虫彩色棉对棉蚜抗性的初步鉴定

将已获得的抗棉铃虫、蚜虫转基因 (Bt GNA)彩色棉纯合品 (株 )系进行了棉蚜抗性评价 ,包括罩笼接蚜试验和田间自然感蚜。结果表明 ,在天彩科技园 ,罩笼内抗虫转基因彩色棉蚜害指数减退率分别比受体对照品种减少 2 1 7%～ 30 43%,蚜体变小 ,蚜重减轻 ;罩笼外有蚜株率和卷叶株率比对照略有下降 ,蚜害指数减退率在 - 1 4 2 9%～ 5 4 1 6%之间。在卡尔墩彩色棉试验基地 ,在罩笼内抗虫转基因彩色棉蚜害指数减退率为 - 33 33%～ 5 8 34%;罩笼外有蚜株率和卷叶株率比对照略有下降 ,蚜害指数减退率在 - 2 7 76%～ 40 0 0 %之间。不同品种间棉蚜抗性有差异。     

苹果sMdCAX1基因超表达载体的构建及遗传转化

为使sMdCAX1基因能在苹果中高效表达,改善苹果对Ca~(2+)吸收转运的能力,本研究构建了sMdCAX1植物超表达载体并将其通过农杆菌介导法转入长富6号苹果中。根据MdCAX1基因序列设计引物,从长富6号中克隆MdCAX1基因,通过PCR方法截除编码MdCAX1基因的N末端序列,获得sMdCAX1片段。利用重叠PCR方法将sMdCAX1序列中的SacI位点进行定点突变,并在序列两端分别添加BamHI和SacI酶切位点,获得长度为1272bp的突变序列sMd1+2Mu。利用BamHI和SacI双酶切sMd1+2Mu和植物表达载体pYH4215,目的片段经回收、连接、转化和筛选,获得植物双元表达载体pYH4215-sMd1,并将该载体转化农杆菌菌株EHA105。以长富6号无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化获得了转基因植株,经鉴定,有6个株系呈GUS染色阳性,其中2个株系呈PCR阳性。进一步对PCR鉴定阳性的株系进行RT-PCR分析,表明sMdCAX1基因在这2个株系中得到表达。本试验结果为进一步研究苹果MdCAX1基因的功能和通过转基因方法提高苹果果实钙含量奠定了基础。     

人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

水稻醇溶蛋白4a基因启动子在转基因水稻中的特异性表达

利用ＰＣＲ方法从水稻“中花８号”基因组中扩增出醇溶蛋白４ａ基因启动子后,将其与ＧＵＳ基因融合,通过基因枪法导入水稻“台北３０９”中。对转基因水稻植株进行的组织化学分析表明,ＧＵＳ基因特异性在种子的胚乳中表达,而在其它的组织中没有表达。水稻醇溶蛋白基因４ａ启动子的胚乳特异性表达可以稳定遗传到下一代。     

AtUGAE4基因反义表达载体构建及对烟草（N.tabaeum L．）的转化

本研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)gDNA中克隆了AtUGAE4基因的家族保守序列片段,反向连接在AtHSP70热激启动子和NOS终止子之间,构成含有该基因反义表达盒的表达载体pV-70brUGAE4,并经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功导入烟草基因组.这为探讨抑制UGAE家族基因表达对植物果胶生物合成和对离体培养细胞的细胞粘连性的影响奠定了基础.     

苹果山梨醇脱氢酶(NAD-SDH)基因的克隆及其反义表达载体对农杆菌的转化

山梨醇是一种糖醇,是蔷薇科植物所特有的,是蔷薇科植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质(B ieleskiand Redg-w ell,1995),在其糖代谢中占有重要地位。另一方面,山梨醇能够提高植物抗环境胁迫的能力(徐迎春等,2001;Brow n etal.,1999)。N A D-山梨醇脱氢酶(N A D-SD H)是山梨醇     

商陆抗病毒蛋白基因转化芥菜的获得及抗性研究

以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将商陆抗病毒蛋白基因PAP导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单拷贝,少数为双拷贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

提高外源基因在转基因植物中表达效率的途径

利用转基因技术获得具有目的性状的转基因植株,是进行作物品种改良的有效方式.但基因沉默等现象降低了外源基因在转基因植物中的表达效率.从外源基因的DNA修饰水平、翻译后蛋白的定位、以及转基因方式等方面综述了国内外植物基因工程中的相关研究;分析了外源基因表达效率低的原因;提出了克服基因沉默并实现外源基因高效表达的途径.     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

CryIA(c)转基因结球甘蓝的抗虫性研究

以结球甘蓝（Brassica oleracea var．capitata）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白基因CryIA（c）导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA（c）和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA（c）基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40％，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。     

苹果短链脱氢酶基因MdSDR响应腐烂病菌侵染的功能研究

短链脱氢/还原酶(SDR)是一类NAD(P)(H)依赖的氧化还原酶,负责催化生物体内各种代谢活动的氧化还原步骤。为了探究苹果(Malus domestica)SDR(MdSDR)蛋白的功能,利用农杆菌介导的苹果组培苗瞬时转化技术在苹果叶片中瞬时表达MdSDR,然后通过刺伤接种法研究过表达MdSDR对叶片抗病性的影响;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测瞬时表达MdSDR后苹果中脂肪酸生物合成相关基因的表达水平;利用气相色谱分析技术检测瞬时表达MdSDR苹果叶片中的脂肪酸含量;利用尼罗红染色检测苹果叶片中的脂滴(LDs)积累情况。结果表明,瞬时表达MdSDR显著增强了苹果叶片对腐烂病菌(Valsa mali)的抗病性,试验组叶片病斑直径相比对照组减小约14.46%(P<0.001);瞬时表达MdSDR后苹果叶片中脂肪酸生物合成相关基因的表达显著上调(P<0.001),其中MdACCase上调48.41倍,MdKAR上调129.79倍,MdENR上调168.20倍,MdHAD上调8.67倍,MdβCT、MdKASⅠ和MdKASⅡ均上调约5倍;然而过表达MdSDR后苹果叶片中脂肪酸的积累水平无显著变化(P>0.05);进一步研究发现,过表达MdSDR后苹果叶片中调控脂滴合成的基因MdSEIPIN显著上调表达(P<0.05),脂滴数量大量增加。本研究初步证明MdSDR能够通过促进脂肪酸的合成,间接提高脂滴的数量,从而提高苹果的抗病性,为苹果抗性品种的研究提供了一定的理论基础。     

水稻抗纹枯病基因OsSeh1的克隆及功能鉴定

为了挖掘抗水稻纹枯病的相关功能基因,本研究从日本晴(Oryza sativa L.spp.japonica,var nippobare)水稻品种中克隆了1个编码核孔蛋白的基因,命名为Os Seh1。该基因与拟南芥中的At Seh1同源,且不同植物物种的Seh1具有相同的保守结构域。Os Seh1蛋白定位于烟草叶片细胞核内。水杨酸和纹枯病病原菌均能诱导水稻Os Seh1的表达,水杨酸诱导48h时Os Seh1表达量达到最高值,约为诱导0h的2倍;而立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导24h时Os Seh1表达量达到最高,为诱导0h的3.5倍。接种纹枯病病原菌15d后,转基因过表达水稻植株比野生型抗性高,而RNA干扰(RNAi)植株比野生型更感病。抗病性显著的T1过表达植株中Os Seh1的相对表达量为6~11,比野生型相对表达量高3~4倍,而感病性显著的RNAi植株中Os Seh1的相对表达量为0.2~0.6,表明Os Seh1的表达水平与水稻对纹枯病病菌的抗性正相关。本研究初步证明了Os Seh1在水稻抗纹枯病中的重要功能,为利用水稻自身基因资源提高纹枯病抗性提供了新思路。     

皮肤特异表达c-Myc转基因小鼠的建立与分析

以CMV-PAAV载体为基础载体,以皮肤特异人K14（人角蛋白14）基因启动子替换原质粒中的CMV启动子后,在其多克隆位点区依次插入鼠c-Myc基因的cDNA序列和gfp基因的编码序列,构建了高效表达c-Myc基因的真核表达载体。通过双原核显微注射技术,将线性化的载体DNA注入到C57BL/6小鼠受精卵的两个原核中,然后将注射后状态良好的胚胎移植到代孕鼠的输卵管中,共移植了256枚受精卵,6只受体怀孕,最终获得44只成年小鼠。通过PCR和Southern blot分析证明2只为阳性转基因小鼠,转基因阳性率为4%。Southern杂交结果分析显示外源片断是以多拷贝串联重复的形式整合到鼠染色体中     

辣椒烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因(NADPH)在辣椒中的遗传转化及其抗病性鉴定

为了分析辣椒NADPH基因与辣椒疫病抗性之间的关系,明确其在辣椒抗疫病方面的作用,以辣椒NADPH基因为目的基因,利用载体pBI121构建了植物表达载体pBI121-NADPH,采用农杆菌介导法转化辣椒(Capsicum annuum L.)感病品种B12,获得了5个卡那霉素抗性转化株系。对卡那霉素抗性转化植株进行PCR和RT-PCR分子检测发现,这5个转化株系含有目的基因CanNADPH。应用辣椒疫病抗性离体叶片鉴定技术,鉴定转基因植株对疫霉菌(Phytophthora capsici)的抗病性,结果表明,转基因辣椒的发病率较非转基因植株降低了22.2%,其病情指数降低了46.5%,表明辣椒NADPH基因在辣椒抗疫病方面有重要作用。