转录组荔枝Dof基因家族的鉴定及其表达

单锌指DNA结合蛋白(DNA binding with one finger,Dof)是植物中特有的一类转录因子,在植物生长发育与非生物胁迫响应中发挥非常重要的作用.利用妃子笑荔枝果实发育RNA-seq数据库,采用生物信息学分析方法,对荔枝Dof(LcDof)基因家族的基本理化特性,亚细胞定位,蛋白质保守结构域,进化关...     

小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

【目的】克隆小麦绒毡层退化基因（Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like）,研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础。【方法】以普通小麦品种西农1376（MF-XN1376）为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况。【结果】成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点（pI）分别为4.77、4.66和4.63。TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100%,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96%,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98%和88%;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦（KAE8787147.1）、二穗短柄草TDR（XP_014756384）、水稻TDR（Os02g0120500）和拟南芥AMS（AT2G16910.1）的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料（CMS-XN1376）表达量均高于可育材料（MF-XN1376）;自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核。【结论】TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。     

小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

为了研究小麦NAC转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应,本试验克隆了小麦的TaNAC-B072基因。该基因的开放阅读框长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白,具有1个NAC结构域。多序列比对和系统进化树分析显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。RT-PCR结果显示,在小麦的根和地上部分,TaNAC-B072基因的表达受高盐、渗透和冷胁迫的诱导,初步推测基因TaNAC-B072可能与小麦响应逆境胁迫有密切的关系。     

小麦TaNAC-B072基因的克隆和表达分析

为了研究小麦NAC转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应,本试验克隆了小麦的TaNAC-B072基因。该基因的开放阅读框长度为978 bp,编码蛋白长度为325个氨基酸,推测其分子量为35.75 kDa,等电点为7.06,属于中性蛋白,具有1个NAC结构域。多序列比对和系统进化树分析显示,TaNAC-B072与BdNAC72-like的亲缘关系较近。RT-PCR结果显示,在小麦的根和地上部分,TaNAC-B072基因的表达受高盐、渗透和冷胁迫的诱导,初步推测基因TaNAC-B072可能与小麦响应逆境胁迫有密切的关系。     

甜瓜 ERF 转录因子基因 CmERFII-11 cDNA 克隆及表达分析

根据已报道的甜瓜Cm ERFII-11基因c DNA序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到Cm ERFII-11基因。采用相关分析软件对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光实时定量PCR进行表达分析。结果表明,所克隆的c DNA长度为954 bp,编码255个氨基酸,编码蛋白质的分子量为28.33ku,理论等电点为7.62。该基因在根、茎、叶组织以及授粉后不同时期果实中均有表达,在叶片组织中的表达量最高。     

荔枝GRF基因家族的全基因组鉴定及表达分析

为揭示荔枝（Litchi chinensis）GFR基因的功能,对荔枝生长调控因子（LcGRF）基因家族进行了全基因组鉴定和分析,并研究其在荔枝中的表达模式。基于荔枝基因组数据库,使用生物信息学软件对LcGRFs家族成员进行全基因组鉴定,分析基本理化性质、染色体定位、基因结构、进化关系、蛋白保守基序、顺式作用元件和时空表达情况进行系统分析。共获得12个GRF基因,不均匀地分布在10条染色体上,内含子2～5个。蛋白保守基序分析发现,荔枝GRF蛋白均含有保守的motif1(WRC)和motif2(QLQ),进化分析LcGRF划分为5个亚家族,LcGRFs启动子上存在大量的光、植物激素、非生物胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。不同转录组表达模式结果显示,各个组织中呈现出多样化的表达特征,表明不同成员可能在荔枝不同生长发育过程中发挥调控作用,参与调节荔枝的生长发育。研究显示,荔枝GRF家族成员有12个,划分为5个亚家族。     

花生AhbHLH63基因的克隆与表达分析

bHLH转录因子在调节植物生长发育中起着重要作用。本研究利用转录组测序结果从栽培种花生丰花1号中克隆得到AhbHLH63基因。序列分析显示,AhbHLH63基因有两个剪接体AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2,其ORF分别长1 188 bp和1 152 bp,分别编码395个氨基酸和383个氨基酸组成的蛋白。亲缘关系分析表明,AhbHLH63蛋白含有一个预测的bHLH结构域,与其他植物的bHLH63具有较高的同源性,与苜蓿等的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明,AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2表达模式基本一致,均为组成型表达,在花中表达量最高,茎和叶中次之,在根中表达量最低;在花生种子的不同发育时期,发育中期表达量较高。     

辣椒‘9704A’雄性不育特异基因hsf的克隆及表达分析

对辣椒细胞质雄性不育系‘9704A’和其同核保持系‘9704B’早期花蕾转录组的Solexa测序结果进行分析,发现1个差异性表达基因,其在不育系中的表达比在保持系中的表达高10倍,该基因与番茄、葡萄、拟南芥中的hsf基因同源性分别为87%、73%和70%,推测该基因为辣椒的hsf基因。根据该基因序列设计引物,从辣椒‘9704A’中克隆该基因的全长及核心cDNA序列,克隆到的hsf全长与核心序列与转录组测序获得的序列一致,进一步分析表明,该基因属于hsf基因家族成员。用定量PCR分析hsf基因在‘9704A’和‘9704B’2种辣椒的根、茎、叶和晚期花蕾中的表达情况,结果表明,该基因在不育系叶组织的表达量为其在保持系叶组织表达量的13.7倍,在不育系晚期花蕾中的表达量也为其在保持系晚期花蕾的3倍,而在2种辣椒系的茎中的表达量都很低,在2种辣椒系的根中的表达量均较高。     

葡萄风信子MaMYB1基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄风信子MYB转录因子基因(MaMYB1),并对其进行生物信息学和表达模式的分析。【方法】以开蓝色花的葡萄风信子品种"亚美尼亚"为材料,利用RACE技术得到其MaMYB1基因cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用酵母单杂交方法检测其转录激活活性,并用实时定量PCR方法分析该基因在根、茎、叶及不同发育时期花中的表达特性。【结果】通过RACE-PCR,克隆得到953bp的MaMYB1基因,其开放阅读框长750bp,编码249个氨基酸,推测的蛋白分子质量约为27.7ku,理论等电点为9.3。MaMYB1基因编码的蛋白序列中具有2个典型的MYB结构域R2和R3,且在R3结构域下游含有与BHLH蛋白结合的[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R结构域。MaMYB1与玉米ZmP1及拟南芥MYB12的关系较近。酵母单杂交检测表明:MaMYB1具有转录激活活性。实时定量PCR分析结果表明:MaMYB1在不同组织中均有表达,以在花中表达量较高,且在花不同发育时期表达量差异显著。【结论】从葡萄风信子中克隆到1个新的MYB基因MaMYB1;推测该基因可能参与了葡萄风信子花发育过程的调控。     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

修剪对‘妃子笑’荔枝枝梢和根系发育的影响

以定植于根箱中的‘妃子笑’荔枝为材料,评价修剪对荔枝(Litchi chinensis Sonn.)枝梢和根系发育的影响。设3个处理,对照组荔枝只去除顶芽,未进行枝梢修剪;低位和高位修剪组的修剪口枝梢平均直径分别为13.25mm和9.39mm。结果表明:荔枝低位和高位修剪均显著提早了新梢萌芽和抽梢的时间,但抑制了新梢的伸长。枝梢修剪处理后,新梢的相对生长速率显著小于对照组,新梢成熟时间相对应的比对照组要长。然而,修剪可缩短新梢成熟的绝对时间,有利于培育较早成熟的枝梢。修剪对荔枝根长密度没有显著影响,但显著降低了根系的生长速率。因此,修剪可促进荔枝新梢的萌发和成熟,但早期会抑制根系的生长速率。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

马尾松PmMYB169基因的克隆及表达分析

MYB基因家族在植物生长发育和应答逆境胁迫中有重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从马尾松中克隆获得了PmMYB169全长cDNA序列,分析了其在低磷胁迫下的表达特性.PmMYB169全长为1 407bp,开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸.生物信息学分析表明,PmMYB169蛋白序列中存在MYB家族结构区域,属于R2R3类MYB转录因子;同源性分析表明,PmMYB169在MYB家族保守区域上同源性较高,它与北美云杉亲缘关系最近.荧光定量PCR对低磷胁迫下PmMYB169的表达分析结果表明,PmMYB169的表达量随低磷胁迫时间延长呈上调趋势,说明PmMYB169参与了低磷胁迫应答;对不同组织的表达分析发现,PmMYB169为组成型表达,在马尾松根茎叶中均有表达,以叶的表达量最高.     

以‘桂味’‘妃子笑’为砧木嫁接不同荔枝品种亲和性研究

筛选以‘桂味’和‘妃子笑’为砧木的亲和接穗品种,为荔枝品种改良提供研究基础。以‘桂味’和‘妃子笑’为砧木,分别嫁接10个和9个优质荔枝品种,调查统计嫁接后不同荔枝品种嫁接口枝条表皮情况、枝梢长度、生长势等亲和性情况,并分析砧木直径与嫁接成活率相关性。结果表明,‘妃子笑’为砧木,嫁接‘观音绿’时,嫁接成活率最高;嫁接‘桂早荔’‘禾虾串’和‘马贵荔’后,嫁接口平滑、生长势较好,亲和性较高;当砧木直径在10～70mm,成活数达到总嫁接成活数的93%。以‘桂味’为砧木,嫁接‘郁金球’和‘翡翠’后,生长势较差,嫁接口粗糙;嫁接‘MS12’‘MS56’‘MS78’‘MW09’‘冰荔’的亲和性较好;当砧木直径范围在10～50mm,成活数达到总嫁接成活数的99%。综上所述,‘桂早荔’‘禾虾串’和‘马贵荔’与‘妃子笑’亲和性较好‘MS12’‘MS56’‘MS78’‘MW09’和‘冰荔’与‘桂味’亲和性较好,以期为后期荔枝品种结构优化提供指导。     

‘红阳’猕猴桃MYB基因的克隆与表达

为探讨MYB基因在‘红阳’(Actinidia chinesis‘Hongyang’)猕猴桃果实着色过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了‘红阳’猕猴桃的一个MYB转录因子基因。该基因的cDNA全长962bp,序列包含一个666bp的开放阅读框(ORF),编码221个氨基酸残基的蛋白质,其N端具有2个典型的MYBDNA结合域。同源性分析显示,该酶的氨基酸序列与矮牵牛、葡萄、番茄、金鱼草等植物中花青素途径相关的MYB转录因子基因的相似性都达到80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示,AcMYB在‘红阳’猕猴桃中的表达量与花青素含量呈正相关,二者均在果实转色主要阶段维持较高水平,推测该基因在调控花青素合成的过程中起着重要作用。     

生姜转录因子基因ZoNAC17 的克隆与表达分析

NAC类转录因子在植物逆境胁迫应答过程中具有极其重要的作用。为进一步探索NAC转录因子的结构与功能,基于生姜转录组数据库,利用RT-PCR法克隆生姜转录因子基因ZoNAC17,采用数字表达谱分析生姜不同组织的ZoNAC17表达图谱。序列分析结果显示,生姜ZoNAC17基因的ORF长度为1 815 bp,编码604个氨基酸残基,分子量为67.52 k D;转录因子ZoNAC17等电点为4.59,不存在信号肽,为跨膜蛋白,亚细胞定位于细胞核。系统进化树分析表明,生姜ZoNAC17与小果野蕉MaNAC17基因亲缘关系最近。数字表达谱结果表明,ZoNAC17在生姜不同组织中均有较强表达,在成熟组织中的表达量为地上茎叶片根茎。在生姜根茎的发育过程中,ZoNAC17表达量先增加,后逐渐减少,且在生长约3个月的发育期表达量最高。     

小麦TaPAT1-2D基因的克隆与表达分析

GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE, repressor of ga1-3 and SCARECROW)基因家族作为重要的植物转录因子在调控植物生长发育、抵抗逆境胁迫的各种信号转导途径中发挥重要作用。为进一步挖掘该家族小麦抗赤霉病相关基因,从禾谷镰刀菌诱导的小麦转录组测序数据筛选出差异表达基因TaPAT1-2D(TraesCS2D02G198200.1),克隆该基因的全长序列,并对其进行生物信息学和表达模式分析,以及亚细胞定位和酵母转录激活活性研究。生物信息学分析结果表明：TaPAT1-2D序列全长1 668 bp,编码555个氨基酸,分子量约为61.34 ku; TaPAT1-2D蛋白含有典型GRAS功能结构域,在进化关系上与水稻OsCIGR2(LOC＿Os07g39470.1)关系较近;TaPAT1-2D启动子区包含茉莉酸甲酯、脱落酸、生长素等植物激素响应元件与光应答元件等。实时荧光定量PCR结果显示,接种禾谷镰刀菌孢子液72 h后,TaPAT1-2D基因在4个不同赤霉病抗性小麦品种中的相对表达水平明显上调,表明该基因参与赤霉病的响应过程。农杆菌介导的烟草中瞬...     

‘凤丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表达分析

为克隆‘凤丹’(Paeonia ostii)花瓣衰老相关基因PoERF113的序列,分析其编码蛋白性质,探索其在不同发育时期花瓣、不同组织和不同品种的表达模式及对乙烯的响应,采用RT–PCR技术,从‘凤丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相关基因PoERF113。该基因属于AP2/ERF家族,其开放阅读框(ORF)为636bp,编码1个由211个氨基酸残基组成的蛋白,含有1个AP2保守结构域,不包含跨膜结构,蛋白相对分子质量约为53 000,理论等电点(pI)为5.13,为不稳定蛋白,具有亲水性;qRT–PCR分析结果表明,PoERF113基因在露色期、初开期、半开期、盛开期、始衰期、衰败期均有表达,主要在‘凤丹’露色期的花瓣和叶片中表达;在早花‘凤丹’突变株系中表达量最高;PoERF113基因在早花‘凤丹’突变株系与‘凤丹’中的序列相同,不存在碱基差异;PoERF113基因对乙烯有响应,其表达量随处理时间和生育进程的延长呈逐渐升高的趋势,推测该基因可能与乙烯诱导后导致花衰老进程相关。     

MlNAC2基因的克隆及其在南荻根部的表达模式分析

本研究中克隆了南荻MINAC2基因的cDNA序列,该序列全长为933bp,编码产物含310个氨基酸残基,该蛋白质理论上的相对分子质量为34,427.8,等电点(pI)为5.85,不稳定系数为34.84,为稳定蛋白,具有保守的NAM基序,无信号肽和跨膜结构域,推测为亲水性蛋白。亚细胞定位试验证明MlNAC2定位于细胞核,它可能在细胞核内行使功能。转录激活试验揭示MlNAC2是一个转录因子蛋白,且转录激活域位于C端。荧光实时定量PCR分析表明,高盐、干旱、脱落酸、茉莉酸甲酯和机械伤害均能诱导MlNAC2基因在南荻根部表达上调,而低温处理时表达下调。