特异性识别草鱼呼肠孤病毒感染细胞的ssDNA核酸适配体筛选与鉴定

[目的]筛选出能高特异性和高亲和性识别草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染细胞的核酸适配体,为研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV检测技术打下基础,同时为提高水产疫病检测及防控效率提供技术支持.[方法]以草鱼呼肠孤病毒I型(GCRVI)感染的宿主细胞为靶标,采用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)进行特异性核酸适配体筛选,并通过激光共聚焦显微技术和流式细胞术对筛选获得的核酸适配体性质进行系统分析.[结果]筛选获得的核酸适配体GVIK1能特异性识别并结合在GCRVI感染的草鱼肾脏组织细胞系(CIK)表面,但不识别正常的CIK细胞及石斑鱼神经坏死病毒广西株(GNNV)感染的石斑鱼脾细胞(GS);其二级结构具有独特复杂的茎环结构,吉布斯自由能(△G)为-32.93 kJ/mol,无细胞毒性.核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的亲和常数(Kd)为148.22 nmol/L,即核酸适配体GVIK1与靶标细胞间的亲和力极强,达纳摩尔级别.核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点是细胞膜蛋白或膜蛋白相关结构,其在靶标细胞表面的结合位点出现在病毒感染后的第5h.临床试验结果表明,筛选获得的核酸适配体GVIK1可作为高特异性分子探针用于诊断GCRV感染所致的草鱼出血病.[结论]基于SELEX技术筛选获得能特异性识别GCRVI感染宿主细胞的核酸适配体GVIK1,可作为核酸分子探针用于研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术,实现实时监测和有效防控.     

核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病病原菌,在世界各地的食物中毒中,该菌引起的中毒事件数量位居前列。目前,基于抗原/抗体、核酸适配体、细胞等传感元件的生物传感技术已被广泛应用于沙门氏菌的定量检测中。其中,核酸适配体是一种短的核酸序列,具有特异性强、亲和力高、合成速度快、重现性好、修饰方便等优点。核酸适配体的这些优点可能会取代抗体,成为分析领域中的潜在识别探针。因此,核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中具有独特优势。主要综述了核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用研究。首先对沙门氏菌及其常用检测方法进行简单介绍,其次介绍沙门氏菌核酸适配体的SELEX筛选方法,重点对基于核酸适配体的比色、荧光、表面增强拉曼散射(SERS)、电化学等生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用进行详细论述,最后对核酸适配体生物传感技术应用于沙门氏菌定量检测的发展前景进行展望。     

基于适配体的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法

本研究以金黄色葡萄球菌为对象,旨在建立一种基于荧光标记核酸适配体的流式细胞术检测方法。通过优化流式细胞仪检测参数、适配体用量及折叠方式,观察适配体针对不同方式处理细菌的识别效果建立检测方法,并对该方法的特异性和灵敏性进行了验证。结果显示:不经高温变性处理的适配体检测结果最佳,适配体最佳使用浓度为250 nmol/L,对活菌识别效果最强。本实验建立的基于适配体的流式细胞术检测方法特异性强、过程简单,40 min于混合细菌中特异性检测、鉴别靶细菌,为金黄色葡萄球菌的检测提供了一种有效方法。     

利用PicoGreen作为检测探针建立基于核酸适配体识别的玉米赤霉烯酮快速检测方法

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种能对动物和人类产生毒性的真菌毒素。研发灵敏而准确的玉米赤霉烯酮快速检测技术对于保障食品动物安全至关重要。该研究以PicoGree荧光染料为检测探针,利用其仅与dsDNA结合后才发出荧光的特性(激发波长:480nm,发射波长:520nm),当ZEN不存在时,适配体能够与其互补链结合而形成dsDNA,导致荧光强度增强;当ZEN存在时,适配体与ZEN结合而不能形成dsDNA,导致荧光强度减弱。建立了一种基于核酸适配体识别的ZEN快速检测方法。灵敏度试验表明:该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1ppb),线性范围为0.1~1μg/L(0.1~1ppb)。检测时间可以控制在40min内。特异性试验结果表明:ZEN核酸适配体与桔青毒素(CTN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和伏马毒素B_1(FB_1)等真菌毒素不会出现交叉反应。本研究与传统的基于抗体识别的ELISA快检方法进行比较,Kappa值为0.805,表明二者一致性相当。由于核酸适配体价廉,检测时间短,因此本文开发的ZEN检测方法较常用的ELISA方法更具有推广和应用价值。     

牛冠状病毒N蛋白的原核表达及核酸适配体筛选

[目的]对牛冠状病毒N蛋白进行原核表达,利用指数富集的配基系统进化技术筛选N蛋白的核酸适配体,为该病诊断方法的建立奠定基础.[方法]根据牛冠状病毒基因序列,设计N蛋白编码基因特异性引物,扩增目的基因并通过酶切、连接、转化构建原核表达载体pET-28a-N,优化N蛋白表达条件,镍柱纯化获得高纯度高浓度的N蛋白.利用微孔板法,经过包被、封闭、加文库、洗脱、提取、PCR、胶回收和反筛等步骤从原始核酸适配体文库中筛选出N蛋白特异性适配体,连接T载体转入DH5a感受态细胞后,经菌落PCR鉴定和测序获得与N蛋白特异性结合的适配体序列,测定其结合常数,并利用在线软件预测其二级结构.[结果]成功表达出约55 kD的重组蛋白;经微孔板法筛选出67条适配体序列,其中N-12、N-33和N-45出现多次重复,经测定3条核酸适配体均具有环状、发卡结构,利于与目标蛋白稳定结合.[结论]筛选的3条核酸适配体有望用于牛冠状病毒病早期诊断用酶联适配体方法的建立.     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。 更多还原     

适配体制备技术及其在农产品化学污染物检测中的应用

通过指数富集配体系统进化技术筛选的核酸适配体,依靠其特定的三维结构可以和包括小分子、蛋白、核酸,甚至细胞、组织等在内的各种靶分子高亲和力高特异性结合。与传统识别分子抗体相比,具有制备简单、性能稳定、便于标记等优点,成为分析化学领域一种新的分析工具。本文综述了适配体制备技术以及适配体在农产品中农兽药残留、违禁添加物、生物毒素检测方面的应用研究进展。     

基于核酸适配体和阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金比色法检测牛奶中四环素

为满足乳制品中四环素快速检测要求,开发了基于核酸适配体(aptamer)和阳离子聚合物PAH高效聚集纳米金比色检测牛奶中四环素(TET)的新方法。本文优化了PAH和适配体的浓度。最优实验条件下,四环素浓度在一定范围内与A520/A650呈现良好的线性关系,最低检测限(LOD)为95nmol/L,对四环素具有良好的选择性。该方法已成功用于牛奶中四环素的检测,回收率为108%~117%,相对标准偏差为2.9%~3.6%。     

硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷

将腺苷的核酸适配体设计成两段DNA链,一段修饰在硅包银纳米颗粒上,另一段修饰在磁性颗粒上.利用腺苷与其核酸适配体的特异性结合,通过检测磁性分离后上清液中硅包银纳米颗粒的光散射信号变化,实现了腺苷检测.方法的线性范围为8.0×10~(-6)~5.0×10~(-4)mol/L,线性相关系数(r)为0.981 8,其他的核苷不干扰测定.     

SELEX技术及其在植物检疫中的应用前景

SELEX是从人工体外合成的随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的适配体的筛选技术。该技术的基本途径主要是通过人工合成的随机寡核苷酸序列文库,历经筛选、分离、富集得到能与各种配体结合的寡核苷酸适配体,具有高特异性、高亲和力和稳定性良好的特点。本文综述了SELEX技术的发展,介绍了目前的研究进展,以及该技术在植物检疫领域中的应用情况,并对其前景进行分析和展望。     

基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B1的方法

【目的】建立一种基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B_1的方法,为饲料中黄曲霉毒素B_1的检测提供技术支撑。【方法】利用FAM荧光标记的核酸适配体与黄曲霉毒素B_1的特异性结合,而与偶联BHQ1的互补序列无法配对,导致荧光值变化而实现检测。【结果】在优化条件下,链亲和素浓度为100μg/mL,核酸适配体浓度为250nmol/L,互补序列浓度为500nmol/L,黄曲霉毒素B_1在0.01～10.0ng/mL范围具有较好的线性关系,最低检测限为0.01ng/mL;与黄曲霉毒素B_2、黄曲霉毒素G_1、黄曲霉毒素G_2、桔霉素和赭曲霉素A的交叉反应率均较低,饲料样品中添加黄曲霉毒素B_1的平均回收率为91.3%～105.0%。【结论】建立的方法快速、准确、灵敏,选择性好,可用于饲料中黄曲霉毒素B_1的分析检测。     

运用SELEX技术筛选嗜水气单胞菌适配子

以嗜水气单胞菌为研究对象,采用适体筛选技术（ SELEX, system evolution of ligands by exponential enrichment）,利用体外合成的长度为J8个核苷酸的随机ssDNA文库,以嗜水气单胞菌为靶目标进行12轮的筛选,利用生物素一抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测DNA适配子与嗜水气单胞菌的亲和力．研究结果表明：随着筛选轮数的增加,DNA适配子与嗜水气单胞菌结合后显色,A（absorbance）值逐渐增加,亲和力由最初的0．32升到第9轮的0．72．研究已初步筛选到与嗜水气单胞菌具有高亲和力的DNA适配子,为嗜水气单胞菌的二级结构研究及其检测试剂盒的研发提供了基础．     

核酸适配体技术在食品有害物检测中的研究进展

核酸适配体是一段可以特异性识别并结合靶分子的寡聚核苷酸片段,具有亲和力强、稳定性好、易于修饰等特点,已经广泛用于检测、分离纯化和医疗三大领域。基于核酸适配体技术的检测方法得到了迅速地发展,已经应用于小分子、蛋白质、细菌病毒等方面的检测。主要综述了核酸适配体检测食品中有害物的研究进展。     

基于核酸适配体的阳离子聚合物聚集纳米金比色法检测水中睾酮

利用核酸适配体对睾酮特异性识别功能以及阳离子聚合物PDDA(poly dimethyl diallyl ammonium chloride,PDDA)聚集纳米金特性,建立了一种高灵敏度、高特异性测定睾酮的定量方法。在最优实验条件[10 mmol/L PB缓冲溶液(pH 7.4),孵育温度25℃,6nmol/L PDDA,6nmol/L睾酮核酸适配体]下,体系吸光度比值A_(650)/A_(520)与睾酮浓度C呈良好的线性关系,决定系数R2为0.995。该方法可检测睾酮浓度范围为2.27nmol/L~1.8μmol/L,最低检测限为2.27nmol/L,将本方法应用于检测自来水睾酮含量,加标回收率为99.81%~105.04%。本方法具有检测范围广、成本低、操作简便、检测灵敏等优点,具有良好实际应用前景。     

响应面优化诱导子促进印楝悬浮细胞培养产印楝素的研究

通过单因素实验法研究了水杨酸(SA)、萘乙酸(NAA)、壳聚糖(CTS)、吲哚丁酸(IBA)、茉莉酸(JA)、激动素(KT)和甲基茉莉酸(MJ)等7种诱导剂对印楝悬浮细胞培养产印楝素的作用,筛选出SA、NAA、CTS、IBA等4种刺激效果明显的诱导剂,利用响应面法优化了该4种诱导剂的最佳组合为SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS5 4.0 mg/L和IBA 3.0 mg/L,得到印楝素含量的实际值为8.61 mg/g,与理论预测值8.69的相对误差为0.92%。回归方程的预测值和实验值差异不显著,所得回归方程模型拟合情况良好,符合要求。     

蓝莓休克病毒IC-RT-nested PCR检测技术

【目的】蓝莓休克病毒(Blueberry shock virus,BlShV)是蓝莓上主要病毒之一,侵染蓝莓后能够对其产量造成严重影响。研究旨在建立用于BlShV快速检测的IC-RT-nested PCR技术,为该病毒的检测鉴定提供可靠的技术手段。【方法】根据GenBank已报道的BlShV基因序列,设计一对外侧引物(BlShV-F/BlShV-R)和一对内侧引物(BlShV-1/BlShV-2),以感染BlShV的蓝莓病叶为材料,利用免疫IC-RT-PCR(免疫捕获RT-PCR)和nested PCR(巢式PCR)建立BlShV的IC-RT-nested PCR检测技术;分别以BlShV、蓝莓焦枯病毒(Blueberry scorch virus,BlScV)、蓝莓带化病毒(Blueberry shoestring virus,BSSV)、蓝莓叶斑驳病毒(Blueberry leaf mottle virus,BLMoV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)、番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)和健康蓝莓叶片为对象,测定该检测技术的特异性;将BlShV第1轮、第2轮PCR产物分别回收纯化后连接到pMD18-T载体,连接产物转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,进行测序和序列比对验证该检测技术的准确性;将感染BlShV的蓝莓病叶提取液用健康蓝莓叶片提取液进行10倍梯度稀释,测定该检测技术的灵敏度,并与DAS-ELISA方法相比较;利用建立的IC-RT-nested PCR对收集的中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品(53份)和进境美国蓝莓叶片(15份)进行实际检测,并对上述样品采用普通RT-PCR方法进行验证。【结果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功从感染BlShV病叶提取液第1轮PCR扩增出约746 bp大小的目的片段,第2轮PCR扩增出约486 bp大小的目的片段,未从健康蓝莓叶片提取液和空白对照扩增出目的片段;特异性测定结果表明,IC-RT-nested PCR具有良好的特异性,仅从感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR分别扩增到目的片段,而从BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康蓝莓叶片提取液第1轮、第2轮均未扩增到相应的目的片段;序列分析结果显示,感染BlShV蓝莓病叶提取液第1轮、第2轮PCR产物的序列同预期大小完全一致,分别为746、486 bp,将获得的两轮PCR产物序列与GenBank数据库中的BlShV基因序列进行比对,结果显示第1轮、第2轮PCR产物的序列与已报道的BlShV核苷酸序列一致性均达99%,证实两轮PCR产物均为BlShV特异性产物,进一步验证了扩增结果的准确性;灵敏度测定结果表明,IC-RT-nested PCR的第1轮PCR能够检测到稀释102倍的BlShV病叶提取液,灵敏度与DAS-ELISA相当,经过第2轮PCR,灵敏度提高100倍,能够检测到稀释104倍的BlShV病叶提取液;蓝莓样品IC-RT-nested PCR测定结果显示,2份来自于美国的蓝莓叶片样品扩增出大小约486 bp的目的片段,BlShV检出率为13.3%,而中国福建、吉林、辽宁地区蓝莓叶片样品上均未扩增出相应的目的片段,未检测到BlShV,该检测结果与普通RT-PCR验证结果完全相符,表明建立的IC-RT-nested PCR能够用于蓝莓样品的实际检测。【结论】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特异、准确和灵敏的优点,适合于田间和进出境口岸蓝莓样品上BlShV的检测鉴定。     

适配体的研究进程与思考

适配体（aptamer）是指利用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选获得的能够与靶分子特异结合的短单链DNA和RNA分子。筛选得到的适配体可以与DNA，RNA，蛋白质或其它靶分子结合，影响这些靶分子的性质，从而起到改变与靶分子相关的生物学功能的效果。而且研究发现，适配体在与靶分子相互作用时，不仅序列，它们所形成的三维结构也尤其重要。同时，适配体在生物医药研究方面显示出广阔的应用前景。介绍了适配体的发展历程，以及一些典型适配体的生物学功效。提出了RNA适配体三维结构在与靶分子进行相互作用时可能发挥重要作用，以期为RNA适配体的筛选提供理论思考。     

三七种子的大小对窝眼轮排种器充种性能的影响

【目的】探究窝眼轮排种器型孔尺寸与分级后三七Panax notoginseng种子的适配性对充种性能的影响规律,确定各级三七种子与适配型孔尺寸之间的关系。【方法】将三七种子分为4级,设计了4种不同型孔尺寸的窝眼轮排种器,利用离散元软件EDEM模拟各级种子在不同型孔尺寸排种器中的充种过程,分析各级种子在不同型孔尺寸排种器中的充种性能,得到各级种子适配排种器型孔尺寸,并进行了试验验证。【结果】各级三七种子均有适配型孔排种器,5.0～5.5和6.5～7.0 mm分级段的种子适配排种器型孔尺寸为7.5和8.5 mm;5.5～6.0和6.0～6.5 mm分级段的种子适配排种器型孔尺寸为8.0 mm。各分级段的种子在其适配排种器中充种时,合格指数均大于95.83%,漏播指数均低于2.00%,重播指数均低于2.17%。确定了种子长轴(l)与孔径(L)之间以及高轴(h)与孔深(H)之间的线性关系方程分别为L=0.58l+4.28和H=0.75h+3.96。【结论】排种器充种性能满足了三七播种的农艺要求,为窝眼轮排种器型孔尺寸的设计提供了理论依据。     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。     

基于核酸适配体的纳米金淬灭罗丹明B荧光法检测氨苄青霉素

研究利用核酸适配体与氨苄青霉素的特异性结合效应以及纳米金对罗丹明B的荧光淬灭反应,通过改变反应体系荧光信号的强弱,从而实现氨苄青霉素的定量检测,建立了氨苄青霉素快速检测的新方法。最佳反应体系条件为适配体终浓度20nmol/L,盐溶液NaCl终浓度0.12mol/L,最优反应为温度30℃。在10mmol/L的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲溶液(pH 6.0)的条件下,该方法可检测氨苄青霉素的浓度范围是0.494~2 000nmol/L,其最低检测限为0.494nmol/L,远低于国际相关检测标准。该方法具有检测时效性强、成本低廉、操作简便、反应灵敏等优点,有着良好的推广应用潜能。