稻瘟菌激发子对油菜光合作用及菌核病抗性的影响

以甘蓝型油菜中双9号为试验材料,研究了稻瘟菌激发子溶液对油菜叶片光合作用、菌核病抗性以及叶片 蛋白质表达的影响.研究结果表明:用稻瘟菌激发子喷施油菜叶片能提高油菜的光合速率、增强油菜叶片对油菜菌 核病的抗性.该激发子的使用可诱导油菜叶片中至少5种蛋白质表达量的显著增加.经鉴定,5种蛋白分别为过氧 化物酶、核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、黑芥子酶、苹果酸脱氢酶和一个可能与分子伴侣10功能近似 的蛋白.     

木薯叶片光合作用日变化的差异蛋白分析

以木薯(Manihot esculenta Crantz)栽培种ZM–QZ1为材料,采用蛋白质组学方法,研究一天中06:00、11:00、15:00、19:00和24:00共5个时间点叶片光合作用差异蛋白的变化。结果表明:叶片在15:00时的光合速率最高,在11:00的次之,在24:00的最低;以06:00的为对照,获得其余4个时间点平均差异表达量为对照±2.0倍以上的蛋白质点42个,这些差异蛋白群的功能涉及光合作用、碳代谢、能量代谢和分子伴侣等,其中参与光合作用、碳代谢和能量代谢的蛋白质约占54.8%。与光合作用相关的关键蛋白包括核酮糖–1,5–二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶酶亚基结合蛋白α亚基、Rubisco活化酶和D1蛋白。这些蛋白表达水平与净光合速率在5个时间点的变化趋势一致,表明这些蛋白质的表达水平与光合作用强度密切相关。     

利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因

【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组,鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因,从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油821的叶片总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜染色体v1.5和甘蓝Scaffold v1.0为参考序列,采用TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff标准流程进行差异表达基因（differential expressed genes,DEGs）筛选。对上调和下调DEGs分别采用Cytoscape v3.1.0中的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各3个,以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】过滤低质量reads后,ZY和ZY8D分别保留了26 192 312和28 378 899对高质量reads用于DEGs筛选,其中86.6%和85.8%的reads能准确比对到参考序列上,说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达,其中上调表达基因1 431个,下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应相关,其中,参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid,ABA）刺激响应的基因分别有127和141个,而下调表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid,SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径,而下调表达基因主要富集于植物-病原菌互作和植物激素ABA、SA和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号转导途径。qRT-PCR检测6个DEGs的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】RNA-Seq分析鉴定出3 657个甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。     

柽柳cDNA文库的构建及ThAQP基因的表达

【目的】构建NaCl胁迫下柽柳根部cDNA文库,在盐胁迫下检测柽柳水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)基因的表达,探讨AQPs与柽柳耐盐性的关系。【方法】以0.4mol/LNaCl胁迫处理的刚毛柽柳(Tamarix hispida)根部组织为试材,分别构建未经盐胁迫及胁迫24,48h的cDNA文库,并测定文库滴度。对从文库中获得的EST序列进行拼接,获得刚毛柽柳AQP(ThAQP)的单一序列,对其进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法,研究ThAQP基因在盐胁迫后的刚毛柽柳根和叶中的表达情况。【结果】构建的NaCl胁迫0,24,48h3个文库的初始滴度分别为1.0×106,1.4×106和1.2×106pfu/mL,插入片段的平均长度分别为0.8,0.9和0.85kb,平均重组率为98.2%。文库克隆随机测序获得了刚毛柽柳的7条ThAQP基因单一序列,这7条ThAQP基因分别与水通道蛋白的4个亚家族成员基因具有很高的同源性。在根和叶中,这7条ThAQP基因表达对盐胁迫的响应不同,在根部ThAQP1～ThAQP4相对表达量增多,而其他基因的相对表达量变化不明显;在叶部,ThAQP7在胁迫24h时相对表达量出现小幅度上升,而其他6条ThAQP的相对表达量则明显下降。【结论】ThAQP基因可能与柽柳抵御盐胁迫有关。     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT–PCR方法克隆了甘蓝型油菜湘油15号5个WRI1基因cDNA。测序结果显示,BnWRI1–1大小为1 248 bp,BnWRI1–2和BnWRI1–3大小为1 254 bp,BnWRI1–4、BnWRI1–5大小为1 242 bp;聚类分析结果显示,所克隆WRI1基因cDNA在进化关系上属于AP2/ERF转录因子家族,同拟南芥AtWRI1(At3G54320)同处1个分支,并且所克隆基因cDNA来自甘蓝型油菜不同的基因组;通过核苷酸序列比对分析,得到所克隆WRI1基因cDNA单核苷酸变异位点40个;特异性酶切位点分析显示,来源于A基因组的BnWRI1–1、BnWRI1–2、BnWRI1–3第892位与来源于C基因组的BnWRI1–4和 BnWRI1–5第880位的核苷酸发生变异,导致Bcl I识别位点的变化;酶切试验结果表明,采用BclI酶可区分甘蓝型油菜的AtWRI1–like WRI1 基因的A或C 基因组来源。     

甘蓝型油菜响应干旱胁迫的转录组分析

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国主要油料作物之一,为国家粮油安全提供了重要保障。干旱严重限制了油菜种植规模扩大、产量与品质提升。为挖掘甘蓝型油菜抗旱的关键基因,阐明油菜耐旱机制,本研究以甘蓝型油菜湘油15为对象,通过实验室模拟干旱处理后的叶片为材料进行转录组测序(RNA-Seq)、生物信息分析并qRT-PCR验证。发现转录组样本平均Clean baseas约为9.6 G,且各样品碱基百分比(Q30)大于93.21%,比对到参考基因组上的Reads在89%以上。干旱处理4 h后,湘油15出现了440个差异表达基因(DEGs),其中148个基因上调,292个基因下调。随机选取10个基因(上调与下调各5个)进行qRT-PCR验证,其中9个基因的qRT-PCR结果与RNA-Seq结果相符,仅1个基因表达趋势相反,相似度可达90%,证实转录组测序结果的可靠性。结果表明甘蓝型油菜湘油15主要通过光合作用、碳代谢和渗透调节等途径调节抗旱能力,为进一步阐明油菜耐旱机制奠定了基础。     

耐旱性甘蓝型油菜品种的筛选及其在干旱胁迫下生理生化特征的研究（英文）

[目的]筛选甘蓝型油菜耐旱种质资源,并分析其干旱胁迫下生理生化变化。[方法]以40个不同甘蓝型油菜品种(系)为材料,采用PEG-6000模拟生理干旱胁迫和盆栽极限干旱胁迫等方法进行耐旱种质资源的筛选,并对干旱胁迫下叶绿素含量、类胡萝卜素含量、脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性的变化进行了研究。[结果]筛选鉴定出一批耐旱性甘蓝型油菜品种:YAU200908、湘油15号、YAU200903、YAU200907、YAU200906、YAU200904。生理生化分析表明,在干旱胁迫下,油菜叶片中叶绿素、类胡萝卜素的含量随干旱程度的加剧而降低,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA的含量及SOD、CAT、POD的酶活性则随着干旱程度的加剧而升高。[结论]在抗旱性强的材料中,其类胡萝卜素的含量显著地减少,脯氨酸、可溶性糖、MDA的含量及SOD、CAT的酶活性显著增加,可作为油菜抗旱性鉴定的生理生化指标。     

天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。     

甘蓝型油菜抗旱机制及育种研究进展

干旱胁迫是农业生产上长期存在的非生物逆境因子,严重影响甘蓝型油菜的生长发育和产量。近年来,国内外研究人员尝试采用各种生物学手段解析甘蓝型油菜的抗旱遗传机制,培育抗旱甘蓝型油菜品种。简要概述了甘蓝型油菜抗旱相关性状QTL定位、干旱胁迫下的应答蛋白等抗旱分子机制及抗旱育种方面的研究进展,为提高甘蓝型油菜抗旱性提供相关理论参考,以加快甘蓝型油菜抗旱育种的研究进程。     

甘蔗ATP结合蛋白基因克隆及其干旱胁迫下的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗ATP结合蛋白基因,分析其基本生物学信息及在干旱胁迫下的表达特性,为ATP结合蛋白的功能研究提供理论依据.[方法]从乙烯诱导甘蔗差异表达转录组和水分胁迫下甘蔗cDNA文库中获取ATP结合蛋白基因序列,设计其引物进行RT-PCR扩增,利用生物信息学软件进行序列分析及其蛋白结构和功能预测,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测干旱胁迫处理下的甘蔗ATP结合蛋白基因的表达情况.[结果]克隆获得的甘蔗ATP结合蛋白基因全长2145bp,编码714个氨基酸,其蛋白分子质量为79.430kD,理论等电点(pI)为9.33,不稳定系数为44.38;甘蔗ATP结合蛋白与玉米ATP结合蛋白的核苷酸序列及其推导氨基酸系列同源性最高,均达93%.甘蔗ATP结合蛋白主要由无规则卷曲(42.02%)、α螺旋(25.63%)和延伸链(22.27%)结构组成,具有蛋白激酶催化结构域、ATP结合位点、核苷酸结合位点(NBS)、糖基化位点、激酶磷酸化结合位点及核定位信号等;甘蔗ATP结合蛋白可能主要定位在细胞核、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体中,起中间代谢调控作用,或参与转录调控、免疫应答、胁迫应答及信号转导等生物反应.qPCR检测结果显示,在干旱胁迫7d后,甘蔗ATP结合蛋白基因的表达量明显下调,约为对照的30%,恢复正常供水(复水)后,表达量回升.[结论]甘蔗ATP结合蛋白基因表达受干旱胁迫诱导,可能参与甘蔗对干旱逆境胁迫响应的代谢调控.     

湖北麦冬叶片碳代谢对土壤干旱的响应

为探讨植物碳代谢对土壤干旱的响应,以湖北麦冬为供试材料,采用盆栽试验,研究持续干旱20 d对叶片内叶绿素含量、核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)活力、非结构性碳(可溶性糖和淀粉)及脯氨酸含量的影响。结果表明,当干旱持续10 d时,光合色素含量和Rubisco活力均显著降低(P 0.05),可溶性糖和脯氨酸含量显著升高(P 0.05),与此同时,淀粉含量显著降低(P 0.05)。表明在干旱条件下湖北麦冬对叶片内的碳水化合物进行了重新分配和利用,将有限的碳更多地分配给可溶性糖和脯氨酸等富碳分子,以提高细胞的渗透调节能力,从而抵御干旱胁迫。但随着干旱时间的进一步延长,碳代谢及渗透调节能力均降低。     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

干旱胁迫对油菜花期光合特性的影响

为研究花期干旱对油菜光合特性及产量的影响,以西藏当地推广的油菜代表品种芥菜型油菜(Brassica juncea L.)年河1号、白菜型油菜(Brasscia rapaL.)青油17号和甘蓝型油菜(Brasscia napus L.)藏油5号为材料,采用盆栽控水试验,在油菜花期分别进行持续1周、2周和3周的干旱处理,然后恢复正常水分管理直至成熟收获,比较3个油菜品种的光合生理及产量变化。结果表明:干旱胁迫造成产量下降且存在处理间差异;以产量为依据,油菜花期干旱的敏感性依次为甘蓝型油菜藏油5号白菜型油菜青油17号芥菜型油菜年河1号;干旱胁迫导致3个油菜品种的净光合速率(Pn)降低,气孔限制值(Ls)升高,各品种处理间水分利用效率的变化趋势与光合速率和气孔限制值的变化存在一致性。为应对干旱对光合机构的破坏,荧光参数PSⅡ实际光化学效率、表观光合电子传递速率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)均有下降,而初始荧光(Fo)升高。研究不同程度干旱处理对产量的影响可为持续干旱对大面积油菜生产影响的估算提供依据。     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签（EST）,序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

Screening of Drought-tolerant Brassica napus L. Varieties and Analysis on Their Physiologic and Biochemical Variations under Drought Stress

[目的]筛选甘蓝型油菜耐旱种质资源,并分析其干旱胁追下生理生化变化。[方法]以40个不同甘蓝型油菜品种（系）为材料,采用PEG-6000模拟生理干旱胁迫和盆栽极限干旱胁迫等方法进行耐旱种质资源的筛选,并对干旱胁追下叶绿素含量、类胡萝卜素含量、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、过氧化物酶（POD）活性的变化进行了研究。[结果]筛选鉴定出一批耐旱性甘蓝型油菜品种：YAU200908、湘油15号、YAU200903、YAU200907、YAU200906、YAU200904。生理生化分析表明,在干旱胁迫下。油菜叶片中叶绿素、类胡萝卜素的含量随干旱程度的加剧而降低,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA的含量及SOD、CAT、POD的酶活性则随着干旱程度的加剧丽升高。[结论]在抗旱性强的材料中,其类胡萝卜素的含量显著地减少。脯氨酸、可溶性糖、MDA的含量及SOD、CAT的酶活性显著增加,可作为油菜抗旱性鉴定的生理生化指标。     

花生叶全长cDNA文库的构建和部分表达序列标签分析

以‘闽花6号’品种为材料,利用SMART技术成功构建了花生叶不同生育时期混合的全长c DNA文库,并对文库的部分序列进行测序及分析.结果表明,该文库原始库容为2.25×106cfu·m L-1,重组率达100%,插入片段大小为750-2000bp,平均插入片段大小为1000 bp,达到文库质量要求.随机挑选50个单克隆进行5'端测序,共获得50条有效序列.通过与NCBI非冗余蛋白质数据库进行比对和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因25个,未知功能基因14个,新基因11个,其中49个(98%)基因为花生未报道的基因.参与代谢过程和胁迫响应的基因表达量较高.     

甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建

根据拟南芥MS1基因已知保守序列设计特异性引物,分离克隆甘蓝型油菜中与拟南芥MS1基因同源的基因片段。应用PCR-Walking技术获得甘蓝型油菜核雄性不育基因BnaX.MS1.a,其全长3 424 bp。BnaX.MS1.a基因与拟南芥MS1基因全长序列同源性为60.3%,编码序列同源性为89.5%。根据基因序列比对结果推测开放阅读框长2 004 bp,编码667个氨基酸,分子量为765 kD,等电点为8.01。BnaX.MS1.a基因编码的氨基酸序列与已知拟南芥MS1基因编码的氨基酸序列同源性达93%。构建BnaX.MS1.a基因的amiRNA载体转化甘蓝型油菜,旨在研发核不育基因工程油菜。