赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白及mTOR信号通路相关基因表达的影响

为了在探究单一添加不同浓度的赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞的增殖,以及mTOR信号通路介导的酪蛋白合成相关基因的影响.试验用厄尔平衡溶液(EBSS)代替正常培养基来处理原代奶牛乳腺上皮细胞,在此基础上依次添加不同浓度的赖氨酸,采用MTT法检测细胞12h和24h的增殖和利用qRT-PCR技术检测4个编码酪蛋白基因和8个mTOR信号通路中与乳蛋白合成翻译相关基因的相对表达量.结果表明:添加赖氨酸12h,浓度为0.5~24mmol/L时,原代奶牛乳腺上皮细胞增殖数量增加(P=0.05);添加赖氨酸24h,浓度为0.5~8mmol/L时,细胞增殖数量增加(P0.01).当赖氨酸的添加浓度为0.5~16 mmol/L时,CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因表达均显著上调(P0.01).当赖氨酸添加量为0.5~16mmol/L时,mTOR和raptor基因的表达量显著上调(P0.05).在添加不同浓度的赖氨酸时,下游通路信号因子S6K1、4EBP1和eEF2基因表达均显著上调(P0.01);rps6基因表达上调,eIF4E基因表达下调,但差异均不显著.以上结果表明,补充赖氨酸能显著促进乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成,这一过程与mTOR信号通路介导蛋白质合成相关.     

CSN1S2和CSN3基因表达量与西农萨能奶山羊产奶性状的关系

【目的】研究酪蛋白中αs2酪蛋白(CSN1S2)基因和K酪蛋白(CSN3)基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量及其与产奶性状的关系。【方法】根据山羊CSN1S2和CSN3的mRNA序列(CSN1S2:AJ289716,CSN3:EF564258)设计实时定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR法,对年均产奶量不同的3组西农萨能奶山羊进行mRNA转录水平上的相对定量分析,并测定乳脂和乳蛋白的含量,同时对扩增出的mRNA片段进行克隆测序。【结果】CSN1S2基因在第1组15只西农萨能奶山羊(年均产奶量为(1 100.00±15.00)kg)乳腺组织中的相对表达量是第2组15只奶山羊(年均产奶量为(600.00±12.00)kg)的2.47倍,二者差异极显著(P0.01);CSN3基因在第1组西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量是第2组的3.10倍,二者差异极显著(P0.01);测序后进行序列比对发现,目的mRNA片段与山羊CSN1S2和CSN3基因的同源性均为100%;CSN1S2基因在西农萨能奶山羊乳腺组织中的表达量与乳汁中蛋白质含量相关性不显著,与脂肪含量呈显著负相关;CSN3基因的表达量与乳汁中蛋白质含量呈显著正相关,与脂肪含量相关性不显著。【结论】CSN1S2基因和CSN3基因在西农萨能奶山羊乳腺中的表达量对乳蛋白和产奶量有显著影响(P0.05),可作为西农萨能奶山羊产奶性状选育的候选基因。     

β-酪蛋白基因在不同乳腺上皮细胞中表达的初步分析

应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中β-酪蛋白mRNA进行检测以评价GMEC乳蛋白合成的功能.同时,比较商品化小鼠乳腺癌细胞C127、人乳腺癌细胞系T47D中β-酪蛋白基因的转录表达.结果表明,原代培养山羊乳腺上皮细胞GMEC-1能够检测到β-酪蛋白基因的表达,在激素诱导下,GMEC-3细胞中能检测到β-酪蛋白基因mRNA,但C127和T47D细胞系中均无法检测到.     

赖氨酸二肽对奶牛乳腺mTOR信号通路元件基因表达的影响

为研究赖氨酸二肽对奶牛乳腺组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响,在体外培养的奶牛乳腺组织培养液中分别添加赖氨酸—赖氨酸、赖氨酸—亮氨酸和赖氨酸—组氨酸二肽,等量取代培养液中φ=5%、5%和15%的游离赖氨酸(赖氨酸总质量浓度为210 mg/L);在此基础上,在赖氨酸组和赖氨酸—赖氨酸二肽5%取代组分别添加终浓度为0和100 nmol/L的mTOR抑制剂雷帕霉素。试验结束后收集乳腺组织用于αs1酪蛋白、mTOR、4E-BP1和S6K1的基因表达检测。结果发现,与游离氨基酸相比,添加3种赖氨酸二肽显著增加αs1酪蛋白、mTOR、4E-BP1和S6K1基因的表达;添加雷帕霉素抑制上述基因的表达,赖氨酸—赖氨酸二肽可以降低雷帕霉素的抑制作用。结果表明,除作为合成底物外,赖氨酸二肽还可能通过调控mTOR信号通路促进乳蛋白的合成。     

不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响,选取5种与泌乳相关的中药(王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦)研究其对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测,并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明,通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达,王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳,其机理尚待进一步研究。     

miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为探索miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响,以奶牛乳腺上皮细胞为体外研究模型,利用miR-200b mimics转染进行miR-200b过表达;应用生物信息学软件分析预测miR-200b靶基因,qRT-PCR检测miR-200b过表达后预测靶基因及乳成分合成相关信号通路关键基因mRNA表达的变化;通过CASY细胞活力分析仪及5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)标记法分别检测miR-200b过表达对细胞活力及增殖的影响;应用CSN2(β-酪蛋白)试剂盒、TG试剂盒及乳糖试剂盒检测细胞胞外分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量的变化。生物信息学分析显示,miR-200b与乳腺泌乳功能基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3b的3'UTR区序列具有互补结合的位点;qRT-PCR分析结果显示,与对照组相比,过表达miR-200b后的奶牛乳腺上皮细胞中Pten mRNA的表达量显著降低,而乳成分合成相关信号通路关键基因Akt、Srebp1、Csn2、Glut1 mRNA的表达量显著上调;miR-200b过表达能够提高奶牛乳腺上皮细胞活力,促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成分泌。综上,miR-200b能够负调控靶基因Pten的表达进而在奶牛乳腺泌乳过程中发挥重要的正调控作用。     

SIRT7对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因表达的调控

[目的]本试验旨在探讨去乙酰化蛋白7(sirtuin 7,SIRT7)对奶牛乳腺上皮细胞(DCMEC)合成乳蛋白、乳脂和乳糖关键基因表达的影响。[方法]以体外原代培养的中国荷斯坦奶牛DCMEC为试验材料,纯化后转染质粒p CDNA3.1-SIRT7,继续培养48或72 h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western blot法检测乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因mRNA和蛋白的表达;通过特异性试剂盒检测胞内和培养基中甘油三脂(TG)含量。[结果]1)乳蛋白:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、β-酪蛋白基因(CSN2)和ETS转录因子基因(ELF5) mRNA水平,促进CSN2蛋白合成,激活雷帕霉素靶蛋白(m TOR)磷酸化; 2)乳脂:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) mRNA和蛋白水平,显著增加细胞内甘油三酯(TG)含量; 3)乳糖:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳糖合成关键因子葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达。[结论]在体外培养条件下,过表达SIRT7可促进DCMEC中乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因的表达。     

山羊β-酪蛋白基因调控区的克隆及启动子活性的检测

为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC island、CAAT box、SAR、AP1、Oct-1、Sm、Glyco、Pu-1、CAC等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点,并且5′调控区可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊CSN2基因5′调控区的有效性,表明克隆的调控区可用于乳腺生物反应器的研究。     

奶牛β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

利用高保真PCR技术扩增了黑白花奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5'和3'调控成分,纯化PCR产物与pMD19-TVector亚克隆后酶切鉴定和测序.结果表明:克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,并且包含有大部分的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点,获得了黑白花奶牛β-酪蛋白基因调控区的克隆.为构建乳腺特异表达载体,指导外源基因在转基因动物乳腺内高效表达奠定了基础.     

脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞毒性作用及乳蛋白合成的影响

试验旨在通过不同浓度的脂多糖(LPS)处理奶牛乳腺上皮细胞,研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞及乳蛋白信号通路关键基因的影响。采用MTT法,LDH活性检测和细胞形态学观察,研究LPS对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用。利用q RT-PCR法和Western-blot技术检测LPS对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成关键基因表达的影响。结果表明,LPS抑制细胞的增殖、增加LDH漏出率,当浓度大于1 000 ng·m L-1时细胞形态学与对照组相比有明显变化,并能抑制奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成关键基因m TOR、S6K1、4EBP1和STAT5 m RNA转录和相关蛋白的表达,与对照组相比差异极显著(P0.01)。研究表明,LPS可通过对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用而影响奶牛的泌乳功能和牛奶品质。     

CSN3、CSN1S2和β-1g基因多态与西农萨能奶山羊产羔数的相关性研究

 首次利用PCR-RFLP技术探讨κ酪蛋白(CSN3)、αs 2酪蛋白(CSN1S2)和β-乳球蛋白（β-lg）基因多态与69只西农萨能奶山羊产羔数的相关性。结果表明：CSN3-TaqI位点与产羔数之间存在显著相关(P<0.05或P<0.01)，如TC基因型个体第1胎产羔数高于CC型（P<0.01），CC基因型个体第2胎产羔数高于CC型（P < 0.05）；CSN3-HindIII位点与产羔数之间不存在关联（P>0.05）；CSN1S2-Alw26I位点与产羔数间存在显著的相关性(P<0.05或P<0.01)，如NF基因型个体第1胎产羔高于NN型（P<0.05），NN基因型个体第4胎产羔数高于NF型(P<0.01)；β-lg-smaI位点与产羔数间不存在显著相关（P > 0.05）。结果提示CSN3和CSN1S2基因对奶山羊产羔数有显著影响, 从而推测酪蛋白基因可能与FecB基因连锁。因此，认为CSN3-TaqI和CSN1S2-Alw26I位点可作为奶山羊高产羔数标记辅助选择（MAS）的有效分子标记。     

用牛αS1-酪蛋白基因构建乳腺生物反应器表达载体的研究

牛αS1-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体,可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。对牛αS1-酪蛋白基因的结构、表达载体的各种调控元件及其研究应用进展等方面作一综述。     

天祝白牦牛αs1-酪蛋白基因和κ-酪蛋白基因的PCR-RFLP研究

利用PCR—RFLP技术熏检测了天祝白牦牛αS1-酪蛋白(αS1-casein,αS1-CN)基因和κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)基因部分序列的遗传多态性熏结果表明:天祝白牦牛群体αS1-CN基因表现单态,κ-CN基因存在遗传多态性。κ-CN基因PCR-RFLP位点等位基因A和B的基因频率分别为0.0745和0.9255。κ-CN基因PCR-RFLP位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定理(P>0.05)。天祝白牦牛群体内平均基因一致度、基因多样度和有效等位基因数分别为0.9311、0.0689和1.0739。     

FLCN对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳功能的影响

FLCN基因参与多种代谢途径和细胞过程,国内外关于FLCN在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。应用RNA干扰技术和质粒转染技术改变FLCN基因在奶牛乳腺上皮细胞中表达量,流式细胞仪检测细胞增殖,采用qRT-PCR和Western blot检测FLCN对泌乳相关功能基因AMPK、mTOR、CyclinD1、Caspase3和β-酪蛋白表达的影响。结果表明,FLCN正向调节mTOR磷酸化水平,促进乳蛋白合成和细胞增殖,抑制细胞凋亡,负调控能量代谢调节子AMPK。FLCN在奶牛乳腺上皮细胞中可通过mTOR信号通路调控细胞增殖及乳蛋白合成,研究对揭示FLCN调控奶牛乳腺上皮细胞增殖和泌乳具有重要作用。     

通草提取物对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响

为探讨通草对奶牛乳腺上皮细胞乳糖合成及相关基因表达的影响,采用不同剂量通草提取物处理奶牛乳腺上皮细胞,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测乳腺上皮细胞增殖能力,乳糖/半乳糖检测试剂盒(Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit)检测乳腺上皮细胞培养液中乳糖含量,实时荧光定量PCR技术检测乳腺上皮细胞乳糖合成相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、葡萄糖转运蛋白8(GLUT8)、葡萄糖转运蛋白12(GLUT12)、己糖激酶Ⅰ(HKⅠ)、己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)、β-1,4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)和α-乳清白蛋白(α-LA)基因mRNA表达水平。结果表明,200、400、600μg(生药)·mL-1通草提取物提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力(P<0.05),促进奶牛乳腺上皮细胞合成分泌乳糖(P<0.05),并显著上调细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1及α-LA mRNA表达水平(P<0.05),但对GLUT4、GLUT12和HKⅠmRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。研究表明,适当浓度通草提取物可提高奶牛乳腺上皮细胞增殖能力,并通过上调乳腺上皮细胞GLUT1、GLUT8、HKⅡ、β-4GALT1和α-LA的mRNA表达,促进乳腺上皮细胞合成乳糖。     

黄花蒿醇提物对奶牛乳腺细胞中共轭亚油酸 合成相关酶基因表达的作用

目的 通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸（CLA）合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。方法 将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO₂浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×10 ⁴个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37 ℃的5% CO₂培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L ^-1 ,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL 基因表达量的影响。每个处理3个重复。结果 使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×10 ⁴个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L ^-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P<0.05),而6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组虽然增加了SCD酶的基因表达量,但与对照组相比差异不显著(P>0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L ^-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有降低乳腺上皮细胞中LPL基因表达量的趋势,呈剂量依赖型降低,且6 mg·L ^-1组和12mg·L ^-1组显著降低了乳腺上皮细胞中LPL基因表达量(P<0.05)。结论 黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。     

人白介素-2基因打靶载体的构建、转染及鉴定

为研究人白介素2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBCI为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2．5kb和下游3．5kb的序列作为5’和3’同源臂,将克隆得到的人白介素2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBN153。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介紊-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶裁体pBN153成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植法制备人白介素-2基因乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

SOCS1基因过表达对猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

【目的】明确细胞因子信号转导抑制因子1基因（SOCS1）过表达对乳腺发育关键信号通路（JAK/STAT）相关基因表达的影响,为揭示SOCS1基因调节猪乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用机制提供参考依据。【方法】构建SOCS1基因过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC,分别转染猪乳腺上皮细胞,然后通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测转染后JAK/STAT信号通路相关基因的表达变化。【结果】以过表达载体pcDNA3.1-SOCS1和阴性对照载体pcDNA3.1-NC分别转染猪乳腺上皮细胞,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的SOCS1基因相对表达量极显著高于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组（P<0.01,下同）;转染48和72 h后,过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组猪乳腺上皮细胞的OD值极显著低于阴性对照载体pcDNA3.1-NC转染组,说明过表达载体pcDNA3.1-SOCS1能有效抑制猪乳腺上皮细胞的增殖能力;过表达载体pcDNA3.1-SOCS1转染组的细胞凋亡率...     

β-酪蛋白基因的研究进展

Corden利用转基因技术首次从小鼠乳腺中分泌得到了人组织源性纤维酶原激活剂，开创了转基因技术的先河。在短短的20多年的时间，转基因技术得到了快速发展。随着转基因技术的广泛应用．越来越多的专家与企业关注到利用哺乳动物的乳腺生物反应器来生产重要的药用蛋白以及稀有蛋白食品。目前，哺乳动物的乳腺生物反应器主要采用β-乳球蛋白(BLG)、酪蛋白(CSN)、乳清酸蛋白(WAP)和乳清白蛋白基因的启动子和调控区。这些区域能够有效地促进外源基因在转基因动物乳腺组织中特异表达。β-酪蛋白(CNS2)是奶蛋白含量较多的一种酪蛋白，在各种哺乳动物的奶汁中都占有相当大的比例。     

伏马毒素B_1对猪肾上皮细胞增殖的影响

研究旨在探究伏马毒素B_1(FB_1)对猪肾上皮细胞增殖的影响,通过MTT检测FB1对PK15细胞活力和qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平。结果表明,FB1显著减少细胞活力,降低细胞核增殖抗原PCNA和周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达水平,升高P21和P27的mRNA表达水平。说明FB1可通过调控细胞周期相关基因的表达抑制猪肾上皮细胞增殖。