两株蜡样芽胞杆菌α-淀粉酶差异性分析及基因的克隆和表达

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶的优良菌株.对2株蜡样芽胞杆菌(B905和B904)分泌的α-淀粉酶酶学性质的研究显示,淀粉酶的活性稳定温度在90～100℃,耐热性和酶活不依赖Ca2 ,但淀粉酶的分子量大小有明显的不同.PCR方法克隆得到了两种耐高温淀粉酶的基因全长(amy905和amy904),并在大肠杆菌诱导表达.结果显示,amy904基因长度为1 362 bp,其蛋白分子量约为55 kD;amy905基因长度为1 761 bp,其蛋白分子量约为68 kD.     

蜡样芽胞杆菌905铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

蜡样芽孢杆菌905（Bacillus cereus 905）是从小麦体内分离获得的一株植物有益内生细菌。为从氧自由基毒性角度分析该细菌在植物体内的定殖机制,本研究利用PCR方法得到了B. cereus 905的CuZn-SOD基因全长（sodC）。该基因由537 bp组成,编码179个氨基酸残基。构建表达载体pET-22b-sodC,转化Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导表达结果表明：该基因表达出的蛋白表现出SOD功能,化学抑制法验证其为CuZn-SOD。     

蜡样芽孢杆菌ATCC14579毒力基因plcR缺失株的构建及其一般特性

蜡样芽孢杆菌是土壤中的优势菌,具有作为益生菌的潜在能力,同时它也是条件致病菌,能引起食物中毒等。蜡样芽孢杆菌的多种毒力因子受到多效性调控子（pleiotropic regulator,plcR）的调控,在其条件致病性作用中起着重要作用。真养产碱杆菌JMP34（Alcaligenes eutrophus）质粒上的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）单加氧酶（tfdA）基因可以降解2,4-D。本研究利用同源重组技术使tfdA基因置换掉蜡样芽孢杆菌的plcR基因,构建了蜡样芽孢杆菌ATCC14579突变株B.cereus△plcRΩtf-dA,并对其毒性、一般生理生化特性进行分析。研究结果表明,突变株B.cereus△plcRΩtfdA的毒性显著减弱;生理生化实验结果显示突变株与野生株并没有明显区别,且突变株并没有表现出tfdA酶活性。所有的结果表明plcR控制着蜡样芽孢杆菌ATCC14579的致病性,同时剔除plcR并不破坏其酶系统。本研究为今后构建蜡样芽孢杆菌工程菌提供了新的思路和依据。     

木霉β—1，3—1，4—葡聚糖酶性质及其cDNA片段克隆

本研究探讨了里氏木霉GXC的-1,3-1,4-葡聚糖酶特性，克隆和分析了酶基因片段。结果表明，粗酶液经硫酸铵沉淀、SephadexG-25、SephadexG-100和DEAE-SephadexA-50柱层析得到纯-1,3-1,4-葡聚糖酶；经12.5%SDS-PAGE凝胶电泳表明，该酶的分子量为35.21kD；酶最适反应pH5.0，最适反应温度为60℃；Michaelis-Menten动力学分析表明，-1,3-1,4-葡聚糖酶的Km和Vmax分别为10.86mg/mL和14286mol/(minmg)。通过RT-PCR方法扩增并克隆了-1,3-1,4-葡聚糖酶cDNA片段，测序表明,该片段长度为280bp；同源性分析显示，该cDNA片段与水解淀粉芽孢杆菌、厌氧真菌OrpinomycesstrainPC-2、枯草芽孢杆菌中的-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因片段有较高的同源性，分别为90%，79%，91%。     

锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性,以不改变氨基酸序列为原则,对源于蜡样芽孢杆菌M22（Bacillus cerues M22）的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成新的基因序列Mn-SOD-2。构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体。结果表明,所构建的酵母工程菌株YM103,经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量为24kD,与预期大小一致。酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好。     

枯草芽胞杆菌重组木聚糖酶基因高效表达系统的构建

以木聚糖酶基因为研究对象,构建了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从芽胞杆菌(Bacillus sp.)基因组DNA中分别扩增出完整和不带启动子的木聚糖酶(xynA)基因;利用芽胞杆菌的强启动子,即S-层蛋白的启动子,通过SOE(splicing by overlapping extension)法连接到xynA基因上得到重组基因S-xynA,将xynA和S-xynA分别装载到整合载体pDG1730上,转化α-淀粉酶高产菌株枯草芽胞杆菌B47,将重组基因整合到α-淀粉酶基因上,以期目标基因像淀粉酶基因一样高效表达。结果表明,2个重组菌的产酶活性均得到提高,其中S-层蛋白启动子表达的木聚糖酶活是自身启动子表达的酶活的1.69倍。重组表达的木聚糖酶在pH5~8和40~60℃范围内均具有较高活性。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

两种淀粉酶的酶学性质及应用研究

研究了两种耐高温α-淀粉酶和两种真菌α-淀粉酶的酶学性质,确定了最佳酶反应条件.将其应用于淀粉糖生产中,以30%的玉米淀粉为原料,用进口耐高温α-淀粉酶水解至还原糖含量为16.5%,再用日本真菌α-淀粉酶在最佳条件下反应21 h,可得到含纯麦芽糖31.1%、葡萄糖1.7%、糊精2.7%的高麦芽糖浆.     

蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

实验成功地构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15，抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^＋表型分析表明，目标基因已经重组到宿主基因组染色体上；0．5％甲醇诱导表达后，SDS—PAGE结果显示，表达蛋白的相对分子量约为23kD，活性电泳出现明显活性条带；酶活性测定显示，重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右；氯仿-乙醇（3：5／V：V）和KCN（5mmol／L）抑制反应进一步证明，所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。     

两种淀粉酶的酶学性质及应用研究

研究了两种耐高温α-淀粉酶和两种真菌α-淀粉酶的酶学性质，确定了最佳酶反应条件。将其应用于淀粉糖生产中，以30%的玉米淀粉为原料，用进口耐高温α-淀粉酶水解至还原糖含量为16.5%，再用日本真菌α-淀粉酶在最佳条件下反应21 h，可得到含纯麦芽糖31.1%、葡萄糖1.7%、糊精2.7%的高麦芽糖浆。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

本研究利用RT-PCR从马铃薯（Solanum tuberosum）茎段总RNA中扩增、克隆了一cDNA分子。该cDNA分子含有一长为1224bp的开放读框,可编码一含407个氨基酸残基的多肽、理论分子量为46.40kD、可能为亲水性的胞外酶。因其氨基酸序列同源于α-淀粉酶,故将该基因命名为amyA1（NCBI收录号：GQ406048.1）。采用半定量RT-PCR方法检测了amyA1基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析了amyA1密码子的偏好性,以期为选择适宜的表达系统提供依据;同时对amyA1的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行了预测。基于NCBI数据库中有物种代表性的29种α-淀粉酶基因序列构建了基因进化树。与NCBI收录的马铃薯α-淀粉酶基因（NCBI收录号：M79328.1）的核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20至第348范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13家族及亚家族相似的催化活性域（PF00128、SM00624）,第349至第407范围内的氨基酸残基含有α-淀粉酶C-末端β折叠区域（PF07821）。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的（β/α）8桶状结构以及其它几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,2个马铃薯α-淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦和玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和测序

从土样中筛选获得一株α－淀粉酶产量的芽孢杆菌菌株,编号为ＸＤ９１３。通过克隆和测序,得到了一个２０９０ｂｐ的ＤＮＡ片段,内含一个编码５１４个氨基酸的基因,经同源性比较,发现该基因与已发表的解淀粉芽孢杆菌的α－淀粉酶基因的同源性高达９９．８％。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

芒果AP1同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个A州同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl—1（GenBankac—cession No．FJ529206）和MAPl—2（GenBankaccession No．FJ529207）。MAPl—1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741bp,蛋白质分子量为28．54kD,等电点为8．31;MAPl—2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744bp,蛋白质分子量为28．78kD,等电点为8．70。同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物A纠同源基因的一致性为72％～81％。实验分析表明,MAPl—1和MAPl—2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异。蛋白二级结构预测显示,MAPl—1蛋白有12个α-螺旋,4个8折叠区,14个β-转角;而MAP1—2蛋白有11个α-螺旋,5个B折叠区,15个β-转角;其大多数氨基酸具有亲水性。本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

球形芽孢杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆、表达与活性鉴定

根据S-腺苷甲硫氨酸合成酶的保守性，利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）基因组中S-腺苷甲硫氨酸合成酶序列信息设计引物。以球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus, B.sph）基因组DNA为模版，扩增获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，酶解后插入大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1，获得重组质粒pGEX-SAM。序列分析表明，来自球形芽孢杆菌的SAM合成酶在基因水平上与大肠杆菌（K02129），枯草芽孢杆菌（Z99129），酿酒酵母（U17246），小鼠（J05571），人（BC018359）的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因，分别有63.9%，75.4%，58.8%，59.1%，55.7%的同源性。由于一级结构存在明显的差异，我们将该重组的质粒转入大肠杆菌DH5α。通过亲和层析纯化出球形芽孢杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶。用HPLC对S-腺苷甲硫氨酸合成酶的活性进行了分析。     

蜡样芽孢杆菌及其生物被膜对有机酸及乙醇的抗性比较

为比较蜡样芽孢杆菌及其生物被膜对环境压力的抗性,该文主要研究了4种有机酸（乙酸、柠檬酸、乳酸和苹果酸）和乙醇对蜡样芽孢杆菌及其生物被膜存活率的影响。结果表明：生物被膜态蜡样芽孢杆菌对乙酸的抗性高于浮游态菌。扫描电镜结果显示,经乙酸处理后,浮游态蜡样芽孢杆菌的细胞表面严重受损,而生物被膜态菌的表面形态未发生明显变化。在柠檬酸、乳酸、苹果酸和乙醇存在的条件下,生物被膜态蜡样芽孢杆菌比浮游态菌表现出更强的压力抗性,特别是在高浓度（有机酸16%～20%,乙醇50%～60%）的情况下,该现象尤为显著。因此,在食品工业中控制被膜态蜡样芽孢杆菌对预防和阻止食品腐败非常重要。该研究结果为实际生产中有效控制蜡样芽孢杆菌及其生物被膜的形成提供参考。     

类芽孢杆菌Bg1抗真菌蛋白的分离及其特性分析

为了明确类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)Bg1的主要抗真菌物质及其特性,本文利用抑菌圈法测定了Bg1抗菌蛋白在各种处理条件下抑菌活性的稳定性;通过60%硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A50离子交换层析及Sephadex G100凝胶过滤层析进行了抗菌蛋白的分离纯化,以SDS-PAGE进行了其纯度检测。结果表明,28~100℃处理30 min、4℃存放55 d及在pH值3~7范围内菌株Bg1抗菌蛋白抑菌活性均无显著性变化,但pH值!8显著影响其抑菌活性,蛋白酶处理则使其抑菌活性完全丧失;纯化后所得抗菌蛋白分子量约10 KD。据此可知,类芽孢杆菌Bg1主要抗菌活性物质为低分子量蛋白,其对热和酸性条件及贮存时间稳定性好,具有进一步开发应用的潜能。