用免疫荧光技术检测细胞培养物中兔出血症病毒

用本所实验室制备的兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）高免血清．按常规方法提纯出抗体（IgG），用异硫氰酸荧光素（FITC）标记IgG。在细胞培养时，培养瓶中放入玻片，当细胞长成单层时，按常规方法接种病毒液，培养24、48、96、120h时取出玻片，用荧光抗体染色，在荧光显微镜下观察不同代次的细胞毒。经观察：兔肾上皮细胞（RK）毒培养到36～48h、羊睾丸细胞（ST）毒培养到72～96h时可观察到特异性荧光，随着培养时间的延长，荧光亮度增强，胞浆内充满特异性荧光。用肝组织强毒病料触片，呈特异性荧光，对照细胞培养48h无荧光出现。证实了两株细胞培养物中有大量的兔出血症病毒存在，从而成功的分离培养出了兔出血症病毒细胞毒。     

用酶联免疫吸附法检测细胞培养物中兔出血症病毒

用本实验室提纯的兔出血症病毒抗体（IgG）,采用改良过碘酸钠（NaIO4）交联法,将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体上,以4×10聚苯乙烯微量酶标板作为载体,用酶联免疫吸附法双抗体夹心法检测了兔肾上皮细胞（RK）培养的RHDV16代、18代细胞毒和羊睾丸细胞（ST）培养的RHDV19代、24代、26代细胞毒,均呈特异性阳性反应,P/N值〉2．1,正常细胞培养物标本为阴性结果,P／N值〈2．1,试验结果与免疫荧光试验相吻合。     

兔出血症病毒接种幼年兔及乳兔的人工感染试验

用兔出血症病毒人工接种一月龄与二月龄幼年仔兔，结果证实兔出血症病毒亦能感染并致死幼年仔兔，但感染类型与青成年兔的典型兔出血症不同，主要特征有病程延长，血凝价低或无血凝和黄疸肝炎等等。用兔出血症病毒特异性单克隆抗体建立的ＥＬＩＳＡ试验及反向间接血凝试验自血凝试验阴性的幼年兔各脏器均能检测到兔出血症病毒。人工感染乳兔虽未致临床病症，但扑杀检查见有坏死性肝炎病变和轻度肾小球性肾炎，且自肝肾等血凝检测阴性的病科中，用ＥＬＩＳＡ试验及细胞培养均可检测和分离到病毒。研究结果表明，血凝阴性并不能排除非典型兔病毒性出血症感染。     

兔出血症病毒ZB株的分离与鉴定

为确定发病兔场兔的死亡病因并对其病原进行鉴定分析,经临床诊断、病理剖检、病毒分离、纯净性检测、血凝性检测、致病性试验、特异性试验、免疫原性试验以及qPCR和测序鉴定,用病死兔病料组织接种健康易感家兔,成功分离到1株兔出血症病毒。分离株病毒不含细菌、霉菌、支原体;对人"O"型红细泡的血凝效价为1∶1024;分离株病毒能够使健康易感兔在96h内全部死亡兔病毒性出血症;兔出血症病毒阳性血清对分离株病毒具有中和作用;用分离株病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性;分离株病毒通过qPCR测序鉴定为RHDV毒株。     

用链球菌自制荧光抗体检测猪链球菌的研究

为达到利用荧光抗体建立一种诊断猪链球菌病的有效方法的目的.先提取兔抗猪链球菌IgG,用FITC标记并进一步用G50过滤,制备出兔抗猪链球菌荧光抗体.同时利用吸收试验、特异性抑制试验对自制的荧光抗体进行了检验.结果表明利用自制荧光抗体进行链球菌病的诊断可在2～3 h内对链球菌作出诊断,比直接镜检更具有特异性和敏感性.试验中发现人工感染小白鼠20h后,小鼠荧光抗体染色均呈阳性,其中以血液及肺脏中荧光强度最强;链球菌荧光抗体染色与葡萄球菌有一定的交叉,与其它几种常见病原菌之间则没有交叉反应.     

用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

兔病毒性出血症的检测及疫苗研究进展

兔病毒性出血症（rabbithemorrhagicdisease,RHD）,俗称“兔瘟”,是由兔出血症病毒引起的一种急性、败血性和毁灭性的传染病,给养兔业带来巨大损失。在该病检测与防控方面,国内外研究者做了许多努力并取得了一定的成果。兔瘟是对养兔业造成最大危害的一种重要病毒性传染病,具有高度接触性致死性。其病原体是兔出血症病毒（rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV）,属于杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）。1984年该病首次在中国发现,在世界范围内迅速蔓延,所有的致病菌株只有一个血清型,RHD导致家兔和野兔的高死亡率,个体感染后多在在48-72h死亡。病理变化为呼吸急促、呼吸系统出血、实质器官瘀血肿大和点状出血以及肝脏点状坏死。虽然细胞培养至今仍未实现,但经过许多科研工作者的不懈努力,还是取得诸多成绩,本文对近几年来有关兔病毒性出血症诊断、疫苗研制方面的取得的最新进展进行综述。     

TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒

应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。     

用PCR技术从一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ技术,对兔出血症病毒核酸作了鉴定,分别设计合成２对ＰＣＲ扩增特异性引物,即按兔出血症病毒中国分离的ＮＪ核酸酸序列合成１对引物（ＮＪ引物）,按国分离的ＦＲＧ株核酸序列民另１对引物（ＦＲＧ引物）,进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ。     

杆状病毒表达的兔出血症病毒衣壳蛋白的自我装配,抗原性及免疫原性

用杆状病毒系统表达了兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）衣壳蛋白。表达产物的分析表明，用抗ＲＨＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ试验可证实６０ＫＤ重组蛋白的抗原性。细胞培养上清和纯化蛋白的直接电镜表明，在昆虫细胞表达的衣壳蛋白可自我装配形成空病毒样粒子（ＶＬＰ），其大小和形态与天然病毒类似。这些病毒粒子与抗ＲＨＤＶ的多克隆抗体以及四个识别病毒构象表位的单克隆抗体（ＭＡｂ）均有免疫反应性。表明ＶＬＰ     

兔出血症病毒缺失突变体的构建及鉴定

为研究兔病毒性出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）衣壳蛋白与病毒侵染性的关系,在RHDV侵染性克隆的基础上,构建了缺失衣壳蛋白（VP60）部分编码基因（5 325-6931 nt）的全长cDNA分子克隆。然后,在体外转录合成RNA,转染RK-13细胞,观察RHDV缺失5 325-6 931 nt区域以后,病毒的侵染性以及病毒复制能力的变化情况。结果表明,5 325-6 931 nt区域缺失以后,病毒的侵染性没有明显改变,但是病毒的复制能力有所下降。可见,该区域含有与病毒复制有关的调控序列或元件。     

兔病毒性出血症病毒“LQ”株的分离鉴定

对成都龙泉某兔场疑似兔病毒性出血症(RHD)发病兔的病料进行细菌学检查以及血凝性、特异性鉴定,并进一步进行致病性鉴定。结果表明:RHDV LQ株对人"O"型红细胞具有高度血凝性,血凝效价达10×212;RHDV抗血清可特异性抑制RHDV LQ株对人"O"型红细胞的凝集;RHDV LQ株对家兔的LD50为10-6.87/mL,是一株对家兔具有高致病力的强毒株。     

基于兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区的间接ELISA方法建立

为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。     

云南省楚雄州部分地区猪瘟血清学调查

为了解楚雄州部分地区的猪瘟免疫情况,利用酶联免疫法(ELISA)对楚雄市、南华县和禄丰县随机采取的393份血清进行猪瘟抗体检测,并对各县(市)的调查数据加以比较,了解猪瘟在楚雄州部分地区的免疫情况。结果显示,楚雄州部分地区均有较高的猪瘟抗体阳性率,各县(市)的猪瘟抗体阳性率都在80%以上,有的县(市)猪瘟抗体甚至达到了100%。说明楚雄州部分地区的猪瘟免疫效果较好,猪瘟免疫成功。     

应用单克隆抗体ELISA阻断试验快速检测兔出血症病毒抗体的研究

利用抗兔出血症病毒(RHDV)的特异性单克隆抗体(McAb)建立了ELISA阻断试验用以检测血清抗体,并与血凝抑制(HI)和琼脂扩散试验(ID)进行了比较。结果ELISA阻断试验敏感性超过HI,更远胜于ID,具有灵敏、特异、准确等优点,适于大批血清样品的快速检测。     

兔出血症病毒遗传与变异的分子基础

兔病毒性出血症是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、高度致死性传染病，病死率高达100％。近年来，由于该病毒血凝性、抗原性的变异，病毒感染宿主增多，不仅对该病的防控造成了一定的威胁，更造成了严重的经济损失。国内外研究学者对该病毒的基因组结构、基因组编码的产物和功能，病毒的宿主和受体以及病毒变异等相关进行了大量深入的研究和分析，为该病毒的防控和治疗提供了技术基础。本文就RHDV遗传与变异的分子基础作一综述，希望能为深入了解该病毒，以及日后的防控提供一定的理论支持。     

灰黄霉素在家兔组织中的分布及残留消除规律研究

研究灰黄霉素在家兔组织中的分布及消除规律,为灰黄霉素用于治疗家兔真菌病的安全性评价提供依据。选择42只新西兰白兔,于饲料中添加灰黄霉素（800g／1000kg）混饲,连续饲喂14d,分别于停药后1、3、5、7、9、14、21d,各处死6只,取其肝、肾、肌肉、皮肤及脑组织。以盐酸普萘洛尔为内标,二氯甲烷提取后用高效液相色谱-串联质谱仪（HPLC—MS／MS）进行各种组织中灰黄霉素浓度分析。结果显示,连续用药14d后,灰黄霉素在家兔组织中的分布情况为：肝组织浓度最高（134．61μg／kg）,肾组织次之（54．09μg／kg）,脑组织浓度最低（未检出）;停药后,随着时间的延长,灰黄霉素在肌肉、肝、肾和皮肤组织中的浓度逐渐下降,且在肝脏中的消除速度最快,停药21d后,灰黄霉素在肾组织中浓度为3．39μg／kg,在肝组织中浓度为12．36μg／kg,其他组织低于定量限或未检出。建议家兔生产中慎用灰黄霉素。