鸭瘟病毒强毒株在急性人工感染成年鸭病例体内分布规律

5 6只 3月龄四川麻鸭经皮下接种鸭瘟病毒 (DPV)强毒 SC1株 ,成功建立了 DPV感染的急性病理模型 ,并应用PCR方法检测了不同时间 DPV在感染鸭体各组织器官的分布情况。结果表明 ,接种 2 h后 ,即能够从脑、肝、脾、法氏囊、胸腺中检出 DPV DNA;12 h,可从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、胸肌、食管、腺胃、血液、舌、口腔分泌物、皮肤、骨髓和粪便等检测到 DPV的 DNA。检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏和脑组织。本试验为阐明 DPV的致病机理和应用 PCR方法检测感染鸭体组织中的 DPV提供了重要的实验数据。     

PCR检测鸭瘟病毒的研究

根据鸭瘟病毒DNA聚合酶基因序列，设计、合成了1对引物，以1株鸭瘟病毒疫苗株DNA为模板，进行：PCR扩增，扩增出预期563bp的目的DNA片段。将扩增出的DNA片段克隆到pMDl8—T载体，经Amp／IPTG／X-gal平板筛选，HindⅢ、XbaⅠ双酶切鉴定，获得阳性重组质粒。对重组质粒进行序列测定，与参考序列比较，二者同源性为99．3％。小鹩瘟病毒、鸭肝炎病毒、鹅副黏病毒：PCR扩增均为阴性。用此方法检测人工感染和自然感染鸭瘟的组织(脑、肝、脾)，均能检测到鸭瘟病毒DNA。PCR检测鸭瘟病毒具有高度的特异性、敏感性，能够用于鸭瘟急性及亚临床感染的检测与诊断。     

聚合酶链反应(PCR)检测鸭瘟病毒方法的建立和应用

鸭瘟(Duck Plague，DP)是由鸭瘟病毒(DPV)引起的鸭、鹅等水禽的一种急性败血性传染病，发病率和死亡率都甚高，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。Baudet(1923)首次在荷兰报道鸭瘟，现该病呈世界性分布。目前实验室检测DPV的方法包括病毒分离鉴定、血清中和试验、反向被动血凝试验、琼脂凝胶沉淀试验、荧光抗体试验、微量固相放射免疫测定法、酶联免疫吸附试验(ELIsA)、核酸探针等”，这些方法用于感染DPV死亡鸭组织中病原的检测存在这样或那样的不足，     

鸭瘟病毒PCR快速检测方法的建立及应用

根据Gen Bank公布的鸭瘟病毒UL30基因保守序列设计了1对引物,建立了检测鸭瘟病毒PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对DPV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对鸭瘟病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明该PCR方法特异性强、敏感性高、简便和快速,可用于鸭瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

鸭瘟病毒弱毒株在免疫雏鸭体内的分布和排毒规律

鸭瘟病毒(DPV)弱毒Cha株经皮下、口服和滴鼻3种途径免疫1日龄雏鸭，应用聚合酶链反应(PCR)检测了病毒在体内分布和排毒规律。Cha株免疫雏鸭后，对血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌、肌肉、骨髓、粪便和食道共19种组织PCR检测结果如下：(1)皮下接种雏鸭后4h，即可在心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑共10种组织中检出DPV的DNA；8h后，所有采取的组织器官均可检测到DPV的DNA。(2)口服接种雏鸭后4h，可在舌和食道中检测到DPV的DNA；8h后，可在心、肝、脾、肾、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌、食道和血液共12种组织器官中检出DPV的DNA。(3)滴鼻接种雏鸭后4h，未能在各种组织中检出DPV的DNA；8h后，可在心、肝、脾、肾、胸腺、延脑、大脑、小脑、舌、食道和血液共11种组织中检测到DPV的DNA。(4)在3种免疫途径中，检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏、脑(大脑、小脑和延脑)；3种途径免疫的鸭，从免疫后12h至21d均能从所有采集的组织中检测出DPV DNA。     

鸭瘟病毒强弱毒株PCR检测方法的建立

根据基因库中鸭瘟病毒强毒株和弱毒株UL2基因保守区设计特异性引物,优化PCR反应的引物浓度和退火温度等,初步建立了可同时鉴别鸭瘟病毒强毒株和弱毒株的PCR检测方法,并对建立的方法进行了敏感性、特异性验证和临床样品检测。该PCR检测方法最低能检出1pg的鸭瘟病毒强毒和弱毒DNA模板。对鸭瘟病毒强毒和弱毒模板的检测,得到了与试验设计相符的827bp(强毒)和299bp(弱毒)的扩增条带,而对鸭副黏病毒、鸭坦布苏病毒、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭Ⅰ型肝炎病毒、禽流感病毒和小鹅瘟病毒等病原体的检测均为阴性。说明建立了一种敏感性高、特异性好的鉴别鸭瘟病毒强毒和弱毒的PCR检测方法。     

鸭瘟病毒的PCR检测及其产物分析

根据基因库中已有的鸭瘟 Ul6的序列 ,合成一对引物 ,对 3株鸭瘟病毒进行 PCR扩增 ,均扩增出大小约 42 0 bp的特异性片段。进行测序 ,结果表明 3个毒株扩增后的片段均为 42 1bp。经重复实验后确定最佳反应条件 ,按该条件对两例临床病料进行检测 ,结果均出现大小约为 42 0 bp的特异片段。PCR产物与 L ake Andes株的相关序列比较 ,广东毒株与 L ake Andes株同源性较高     

人工感染雏鸭体内DEV强毒的荧光定量PCR检测

将鸭肠炎病毒(DEV)强毒GZ株经腿部肌肉注射感染15日龄雏鸭后,应用建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法检测病毒在雏鸭体内各组织的动态分布。结果显示,感染后3 h即可在肝、脾、脑、胸腺、肾和肺6种组织中检出病毒核酸;感染后6 h,除上述组织外还可在十二指肠和盲肠检测到;感染后10 h又可在胸肌和心肌等检测到。不同受检组织病毒核酸检出量有所不同,由高到低依次为脑、肝、脾、胸腺、肾、十二指肠、盲肠、肺、胸肌和心肌。为阐明DEV的致病机理提供了重要的试验数据。     

鸭肠炎病毒强毒参考株在感染鸭体内的动态分布研究

为了研究鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）强毒株在感染鸭体内的动态分布规律,根据DEV的gD基因序列设计检测引物RT-gDF和RT-gDR,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的检测DEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用已建立的方法,对DEV强毒参考株感染鸭的组织脏器进行了定量检测。结果显示,接种后6 h即可在所有受检组织中检测到DEV DNA,随着病程发展,DNA拷贝数持续升高,直至接种5 d后感染鸭全部死亡。其中结肠病毒DNA拷贝数为最高,达到1013.26 copies,法氏囊、肝脏和盲肠次之,约1012 copies。本研究证实了DEV强毒对感染鸭的免疫器官、神经组织和消化系统均具有广泛的嗜性。     

鸭瘟病毒的PCR鉴定及相关序列分析

设计、合成了2对鸭瘟病毒引物，对云南省发现的1例鸭瘟可疑病例(YN-DPV01)进行PCR鉴定，并对其扩增产物进行测序。结果显示，引物对被检测病料的扩增正确；所扩增的片段经序列测定与参考毒株p481的同源性为99．5％。     

鸭瘟强毒与疫苗毒的囊膜糖蛋白序列比较

2011年,2个免疫过鸭瘟疫苗的樱桃谷北京鸭种鸭群发生鸭瘟。为了解该病发生是否与鸭瘟病毒(Anatid herpes-virus 1,AnHV1)变异有关,从发病场采集4份病死鸭的肝脏样品,用PCR检测和病毒分离进行了鉴定,并经UL2测序和序列分析确定1株AnHV1分离株(W1)具有强毒株的分子特征。在此基础上,测定并比较了W1株和3株AnHV1弱毒疫苗的囊膜糖蛋白序列。结果显示,分离株W1株与3株弱毒疫苗株之间gB、gC、gD、gG、gH、gM、gN和gL蛋白的氨基酸序列完全相同,gE、gI和gK蛋白的氨基酸序列同源性为99%。结果表明,相对于我国养鸭生产中常用的弱毒疫苗株,分离株W1株的囊膜糖蛋白序列未发生明显的变异。     

鸭瘟病毒PCR快速检测方法的建立

根据Gen Bank公布的鸭瘟病毒UL30基因保守序列设计了一对引物,建立了检测鸭瘟病毒PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对鸭瘟病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对鸭瘟病毒检测的灵敏性为1 pg总DNA量。以上结果表明该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于鸭瘟的早期确诊和病毒鉴定。     

应用PCR检测人工感染鸡体内鸡传染性贫血病毒的动态分布

应用聚合酶链反应技术检测人工感染１２周龄ＳＰＦ鸡体内鸡传染性贫血病毒的动态分布结果,感染后第２周可从外周血液白细胞中检出ＣＡＶ－ＤＮＡ,在第３周时达到最高峰,然后逐渐下降,第６周时检出率仅为６．３％,第７周以后均未能从血液白细胞中检测到ＣＡＶ－ＤＮＡ;人工感染后第２－１２周均能从骨髓,胸腺,脾,肾,肝和腔上囊等组织检出ＣＡＶ－ＤＮＡ,其中以骨髓和胸腺的检出率最高,其次脾,肾和肝,腔上囊最低,从１２     

鸭瘟病毒UL35基因PCR方法的建立与初步应用

本研究建立了检测鸭瘟病毒（Duck pl ague vi rus,DPV）的PCR方法,并运用建立的检测方法对分离毒株和人工感染样品进行临床应用检测。根据GenBank（登录号为EF643558）中的DPV UL35基因保守区域,设计合成了一对引物,以DPV疫苗株为模板,优化PCR反应条件,建立了一种快速、有效的DPVPCR方法。结果显示：该方法能从DPV中扩增到与预期大小相符,长度为354 bp的特异性片段,而对禽流感病毒（AIV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新城疫病毒（NDV）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒（GPV）等样品的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到470 ng病毒DNA。应用该方法对3株DPV分离株和6份由DPV BL8毒株人工感染鸭的肝脏和脾脏等组织进行PCR检测均为阳性。表明所建立的DPV PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于DPV的临床诊断和流行病学调查。     

种鸭场鸭瘟的PCR快速诊断

鸭瘟是由疱疹病毒属的鸭瘟病毒引起的鸭、鹅等水禽的一种急性、接触传染性疾病.其特征是侵害血管,组织出血,消化道粘膜糜烂,淋巴器官出现病变,实质器官有退行性的病变.1923年Baudet首次报道荷兰的家鸭暴发鸭瘟,现在各养鸭国家和地区均有发生和流行,是危害养鸭业的最为严重的传染病之一.鸭瘟主要引起鸭的死亡、淘汰和产蛋下降,给养鸭业造成了较大经济损失.     

鸭甲肝病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内分布规律

为研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)在雏鸭体内的动态分布情况,本研究建立了检测DHAV-3的Taqman荧光定量PCR方法,该方法在107~102范围内有良好的线性关系,相关系数0.997,检测下限为22copies/PCR。将200只2日龄雏鸭随机分为4组,依次对每组雏鸭肌肉注射0.2ELD_(50)、2ELD_(50)、20ELD50的DHAV-3(SD1201株)和生理盐水,并于感染后1、2、6、12、18、24、36、48、72、96h从各组分别随机取3只雏鸭,应用荧光定量PCR方法对其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊的病毒含量进行检测。结果表明,DHAV-3于感染后1h即可在3个试验组雏鸭肝脏中检测到,病毒含量为102~103 copies/g,2h后在心脏、脾脏、肾脏、胸腺和法氏囊中均检测到该病毒。各器官中的病毒含量于感染后36~48h达到高峰期,至72h病毒含量仍维持稳定。此外,在整个感染过程中,被检器官中的病毒含量与初始感染剂量呈正相关。本研究结果有助于阐明DHAV-3的致病机理。     

新城疫病毒和鸭瘟病毒二重PCR检测方法的建立及初步应用

根据基因库中新城疫病毒(Newcastle diseases virus,NDV)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的基因序列,分别设计了2对针对NDV和DPV保守基因序列的引物。用这2对引物对同一样品中的NDV和DPV模板进行二重PCR扩增,结果同时得到了2条特异性的、大小与试验设计相符的419(NDV)和602 bp(DPV)的扩增条带,而对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该二重PCR技术能同时检出0.4 pg的NDV模板和126 pg的DPV模板。     

一例引进鸭感染鸭瘟病毒的PCR检测诊断

为诊断某养殖场新引进鸭死亡的病因,通过流行病学调查、临床症状、病理变化及病原核酸PCR检测,确诊为鸭瘟病毒感染。     

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

鸭瘟病毒基因组核酸的制备

用鸭瘟病毒国内标准株DPV34F2接种10—l2日龄的非免疫鸭胚，37℃培养5d后，收获清亮尿囊液，采用高速离心结合切向超滤的方法浓缩纯化含毒尿囊液。然后通过改进的酚：氯仿抽提法提取其中的病毒基因组核酸，用4对特异引物对抽提物进行PCR鉴定。结果表明，应用上述方法可以获得较完整的鸭瘟病毒基因组核酸。