小麦自噬相关基因ATG4和ATG8的原核表达及蛋白纯化

细胞自噬与植物生长、发育和逆境响应等过程密切相关。本研究构建了小麦重要自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h的原核表达载体并导入大肠杆菌。IPTG诱导表达后的蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明,两个基因在大肠杆菌中均能够高效表达,表达重组蛋白的分子量与预测分子量基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白,为今后的体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等研究奠定了基础。     

选择性自噬的研究进展

自噬是真核细胞中高度保守的一种亚细胞降解途径。该途径中,一些损坏、标记的大分子物质(如蛋白质等)或细胞器被自噬体包裹后送入溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中降解并重新利用。长期以来,人们认为自噬在降解大量的细胞质成分时是一种非选择性的过程。然而,最近几年的研究结果表明,无论是酵母还是高等的真核生物细胞中均存在许多类型的选择性自噬。该研究主要综述了近几年选择性自噬过程与分子机制的研究进展。     

原核表达获得Tizip1蛋白

将谷子中的Tizip1基因克隆到原核表达载体pEX-2T中，并使此克隆表达载体在BL21（DE3）宿主菌中表达；用IPTG诱导Tizip1蛋白的表达．结果表明：在30℃利用1mM的IPTG诱导5h可以获得高效的表达产物．     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

小麦重要自噬相关基因ATG18的鉴定和表达分析

【目的】克隆小麦重要自噬相关基因ATG18,分析其编码产物的序列特征和高级结构,了解其在生物、非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式,阐明其生物学功能。【方法】利用EST拼接和RT-PCR方法从白粉菌侵染的小麦叶片中克隆ATG18 cDNA序列,利用生物信息学方法进行基因的外显子-内含子结构分析、编码蛋白的结构域和保守氨基酸预测、高级结构分析和物种间同源蛋白的进化分析。采用实时荧光定量PCR方法研究基因表达对白粉菌侵染和外源激素处理的响应模式及对高盐、干旱、低温黑暗和缺氮培养等逆境胁迫处理的响应模式。【结果】获得了4个小麦ATG18家族成员（TaATG18a、TaATG18b、TaATG18c和TaATG18d）cDNA。4个基因高度相似,均含有1 158 bp开放阅读框（ORF）,编码385个氨基酸的蛋白质。4个基因的编码蛋白在一级结构上均含有典型的WD-40结构域、磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）结合基序和保守的ATG2结合位点氨基酸残基。4个基因均具有2种转录后的可变剪接方式,2种剪接产物mRNA分别编码完整的有功能蛋白和N端截短导致结构域和功能位点缺失的无功能蛋白。TaATG18a蛋白在高级结构上折叠成与其他WD-40蛋白类似的β-推进器样构象,PI3P结合基序位于推进器第五叶片的折叠4和第五、六叶片的连接部分,ATG2结合位点位于连接第二叶片和第三叶片的loop上。TaATG18s能够被白粉菌侵染诱导表达,但具体的诱导表达模式在抗、感白粉病反应之间存在明显差异。在广谱抗白粉病基因Pm21和小种专一性抗白粉病基因Pm3f介导的抗病反应中,TaATG18s均呈现接种白粉菌后0-36 h期间的2次诱导表达模式,2次诱导表达时间与白粉菌侵染进程密切相关。在中感材料扬麦158遗传背景上的感病反应中,TaATG18s尽管也呈现2次诱导表达,但第一次诱导表达持续时间短且强度低于含Pm21的近等基因系上抗病反应中的表现,相反第二次诱导表达强度高于抗病反应中的表现。高感材料Chancellor遗传背景上的TaATG18s响应白粉菌侵染的表达波动较小。外源乙烯或SA处理对TaATG18s表达的调控作用在抗、感白粉病材料上明显不同,在感病材料上表现激活作用,而在抗病材料上表现抑制作用。激素处理对TaATG18s表达的调控不仅作用于转录水平,还作用于转录后的mRNA剪接环节。高盐、干旱、低温黑暗和缺氮培养等逆境处理也能够上调TaATG18s的表达。【结论】推测鉴定的4个TaATG18s编码蛋白具有通过结合PI3P定位于自噬膜表面和通过形成ATG18-ATG2复合物参与小麦自噬过程的功能。TaATG18s及其参与的自噬过程与小麦对白粉菌侵染的免疫反应密切相关,也与小麦响应非生物逆境胁迫环境相关。抗、感材料TaATG18s对同种激素信号的不同响应模式可能是导致抗、感白粉病表型差异的原因之一。     

HSV_1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

禽坦布苏病毒NS1基因的原核表达

根据GenBank中登录的禽坦布苏病毒(avian Tembusu virus,ATMV)WR株非结构蛋白NS1基因设计特异性引物,采用RT-PCR方法从禽坦布苏病毒WR株核酸中扩增其NS1基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上构建原核表达重组质粒pGEX4T-NS1,进行条件优化诱导表达,将表达的目的蛋白经SDSPAGE分析。结果表明,分子量约为62kD的重组目的蛋白得到表达。     

猪源Mx1基因的原核表达及其抗血清制备

利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带。结论:poMx1基因表达成功。     

禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化

根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行 PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,...     

小麦组蛋白H1基因保守序列原核载体的构建及表达

采用PCR技术扩增TAT-H1bs融合基因,并通过基因操作构建了融合基因的原核重组载体pET-28a-TAT-Hlbs。将阳性重组质粒转化至受体菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western-blot检测。结果表明:重组菌能够表达目的蛋白,软件分析结果表明表达蛋白约占菌体蛋白的40%,上清表达量约为20%。上清蛋白经纯化后,Western-blot结果显示,His-Tag单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。所获得的融合蛋白以高效胞质可溶形式表达。     

小麦细胞周期蛋白基因CDC25的原核表达及蛋白纯化

细胞分裂周期蛋白CDC25是一类苏氨酸/酪氨酸双特异性的磷酸酶,在动物上通过激活CDK进而推动细胞周期进程,然而植物CDC25的这一功能可能已经不重要或已被替代,故有关植物CDC25的功能还有待阐明。本研究构建了小麦CDC25基因Ta CDC25.1-1AL的原核表达载体;导入大肠杆菌的Ta CDC25.1-1AL基因能够被IPTG诱导表达,表达重组蛋白的表观分子量与理论分子量基本一致;利用Ni柱亲和层析方法获得了纯度较高的重组蛋白,为今后通过体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等方法深入研究该蛋白和基因的功能奠定了基础。     

扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

【目的】 克隆与分析扁桃脱水素基因,为研究脱水素基因在扁桃抗逆机制中发挥的功能提供参考。【方法】 以新疆栽培的扁桃品种‘纸皮’叶片为材料,通过PCR技术克隆扁桃AcDHN1基因并对该基因进行原核表达分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌进行表达。【结果】 克隆得到了一个脱水素基因,命名为AcDHN1,GenBank登陆号为KT949395,该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽,为稳定的亲水性蛋白,属于Y₂K_n型脱水素,推测蛋白分子质量为32.4 kD,亚细胞定位于细胞核中。将该基因与原核表达载体连接构建重组质粒pET-AcDHN1,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明,该蛋白分子量的大小约为52.7 kD,与预期长度一致。【结论】 对重组蛋白的诱导条件进行优化后结果显示,该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。     

鸡PEPT1抗原表位基因的原核表达及序列鉴定

根据GenBank的原鸡PEPT1基因保守区序列设计引物,PCR扩增得到PEPT1基因抗原表位区序列,将该序列定向克隆至pET22b(+)载体上,成功构建了pET-22b-PEPT1重组质粒。重组质粒在原核表达宿主Rosetta(DE3)中诱导表达出PEPT1抗原表位区蛋白,纯化的表达产物经过质谱分析鉴定,为进一步生产鸡肽转运载体PEPT1的特异性抗体奠定了基础。     

布莱凯特黑牛PID1基因的多态性分析及原核表达

为提高布莱凯特黑牛肉质品质,参照NCBI公布的牛PID1基因mRNA序列设计引物,以117头布莱凯特黑牛为试验材料,提取其眼肌总RNA,通过RT-PCR对布莱凯特黑牛PID1基因cDNA进行克隆测序,对PID1基因的每个外显子进行SNP检测,并分析其多态性。结果显示:布莱凯特黑牛PID1基因cDNA全长2 561bp,包括1个612bp的完整开放阅读框,编码203个氨基酸;在第2外显子上存在2处变异位点,但仅1处位点的突变引起氨基酸序列变化,表明PID1基因在种内保守性较强。     

耐盐基因HAL1的克隆及在原核细胞中的表达

以酵母基因组DNA为模板,采用PCR方法得到耐盐基因HAL1,插入原核表达载体pGEX-4T-1的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建原核表达载体pGEX-HAL1;将该载体转化到大肠杆菌中,重组菌株用IPTG诱导表达,其耐盐性比空白菌株提高50%;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有明显表达的蛋白质条带。     

小麦热激蛋白60(HSP60)基因的克隆与原核表达

[目的]构建小麦热激蛋白60基因的原核表达载体,并在E.coli中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的小麦热激蛋白60基因序列设计合成1对引物P1/P2,利用RT-PCR方法从小麦RNA中扩增小麦HSP60基因,应用基因重组技术构建pGEX-4T-1-HSP60表达载体,将构建好的小麦HSP60基因原核表达载体pGEX-4T-1-HSP60转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21感受态细胞。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定鉴定正确后,与GenBank中收录的小麦HSP60基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下获得了目的蛋白,所表达的GST-HSP60融合蛋白分子量约为90 KD。蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的大小一致。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-HSP60的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了HSP60蛋白,为进一步研究该蛋白的功能及其作用机制奠定了基础。     

内切葡聚糖酶基因的克隆及原核表达

纤维素酶的工业应用一直受成本高、酶活低的限制,而内切葡聚糖酶作为纤维素酶最主要的组成部分,提高内切葡聚糖酶的酶活力显得尤为重要。根据GenBank中收录的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)KCTC的模式菌株和解淀粉芽孢杆菌HZ79内切葡聚糖酶序列的相似性及orf分析设计特异性引物,以解淀粉芽孢杆菌的基因组DNA为模板,利用PCR反应克隆出长为1 500 bp的内切葡聚糖酶基因(egl基因),将目的基因与pMD19-T载体相连,转入大肠杆菌DH5α,阳性克隆经菌液PCR及双酶切验证,将验证正确的质粒送金唯智测序公司测序。比对结果表明:该克隆片段无碱基缺失,无移码突变,扩增序列准确、可靠。将测序正确的重组质粒转化BL21,进行大肠杆菌BL21(DE3)的原核表达,SDS-PAGE分析蛋白的大小为55 ku,等电点为8.12。为后续的内切葡聚糖酶基因突变体文库的建立,及egl酶酶活力及耐受性提高菌株的高通量筛选奠定前期基础。