荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10~(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10~(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。     

西施舌基因组DNA的提取及其RAPD反应条件的优化

通过实验比较获得了一种高效、简便的西施舌基因组DNA的提取方法,以该法提取的基因组DNA为模板,对西施舌RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了研究,初步确定了适于西施舌RAPD分析的最佳反应体系:25μL反应体系中,含模板DNA 25 ng,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTPs 0.3 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,引物15 ng,Taq DNA聚合酶1.5U。     

鳜鱼苗种阶段的鱼病防治

鳜鱼苗种阶段易发病,死亡率高。做好鳜鱼苗种阶段鱼病的防治在鳜鱼的人工养殖方面有着重要的意义。对鳜鱼苗种阶段常见的鱼病及其防治过程总结如下。一、斜管虫病 1.发病情况及症状尽管在养殖鳜鱼前按常规方法消毒了水体,可经过饥饿及长途运输,在水温15—18℃时此病仍极易发生。由于斜管虫在鱼体皮肤及鳃部的刺激与破坏,引起病鱼分泌大量粘液,使皮肤及鳃的表面呈苍白色或皮肤表面形成一层浅灰的薄膜。严重时病鱼漂浮水面,呼吸困难,鳃盖泛     

提高鳜鱼苗种成活率的技术

对鳜人工繁殖及苗种培育等6个方面进行了分析与讨论。     

刀鲚RAPD分析条件的优化

以刀鲚基因组DNA为模板,对刀鲚RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度,dNTPs浓度、引物浓度进行了研究。研究结果初步确定了适用于刀鲚遗传多样性分析的RAPD反应体系为:25μl反应体系中,含10×PCR缓冲液2.5μl,模板DNA20ng, dNTPs0.1m mol/L,Mg~(2+)2.5m mol/L,引物0.4μ mol/L,Taq DNA聚合酶1U。     

网箱中鳜鱼摄食行为的初步观察

对网箱中鳜摄食行为的初步观察结果表明：网箱中的鳜会争食、集群捕食活铒并能主动吞食死饵；摄食高峰在傍晚和拂晓；活饵（鳙、鲢）具有对鳜的防御性行为反应；７－８月鳜日粮、日增重随个体生长而分别增加１１．２倍和６．１倍，饵料系数２．０４－４．０５；饵料鱼（鲢）体长为鳜的体长的４２．３％－５７．８％，平均为５０．６％。     

网箱养殖商品鳜鱼试验

１９９４年，在鼎城区十美堂镇渔场的沙槽河（１２０ｈｍ２，河沟型）进行网箱养殖商品鳜鱼试验。试验网箱３只，１６ｍ２／只。每只投放鳜鱼苗６５０尾，规格８５ｇ／尾。经１３个月饲养，共起水商品鳜鱼１４８４．１ｋｇ，１８２１尾，成活率９３．４％。共创产值７４２０５．７元，投资收益率为１８０．３％。     

池塘主养鳜鱼高产试验

利用一口面积3335m2的池塘,综合池塘处理、饵料鱼投放、放养量确定以及日常管理等手段进行主养翘嘴鳜试验,纯收益25679.20元,每667m2纯收益5125.84元;总产量2120.5 kg,每667m2产鳜鱼424.1 kg,达到高产高效目的。     

基于微卫星标记建立翘嘴鳜亲子鉴定技术

利用9个多态性较高的微卫星标记对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)进行亲子鉴定分析。结果显示,22个家系翘嘴鳜个体中共观测到95个等位基因,其观测杂合度和期望杂合度的平均值(范围)分别为0.578(0.219~0.800)和0.607(0.200~0.806),多态信息含量(范围)为0.552(0.187~0.787)。通过软件Cervus统计分析得到9个微卫星座位累计排除率为99.9658%,在27个可能的父母对条件下,混养养殖家系后代个体鉴定准确率为91%,研究结果表明筛选的这些多态微卫星分子标记可以用于翘嘴鳜优势家系的鉴定和分离,通过验证的微卫星标记建立的亲子鉴定技术为基础选育翘嘴鳜生长速度快的优势家系,为培育出生长速度快、抗病力强的翘嘴鳜新品种奠定基础。     

鳜鱼病毒PCR诊断方法的建立

从ＲＡＰＤ扩增的鳜鱼病毒（ＳＣＶ）核酸电泳带中回收了二个片断，克隆子pUC19质粒（称为ＳＣＶＥ３６９和ＳＣＶＥ４５０），序列分析表明插入片段分别为３６９bp和450bp与ＧenBank序列没有显著的同源，根据克隆序列调计两对引物Ｐ１／Ｐ２和Ｐ３／Ｐ４ ，在健康鳜鱼，病鳜以及提纯的ＳＣＶ核酸中进行ＰＣＲ试验，结果表明，Ｐ１／Ｐ２组引物在ＳＣＶ基因组中扩增出特异性核酸片段，可作为鳜鱼病毒ＰＣＲ诊断，检测片段为３６９bp.     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

FIASCO法筛选鳜鱼微卫星标记

通过FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)法构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。鳜鱼基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,选取200~800 bp的片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建鳜鱼基因组微卫星富集文库。对其中100个阳性克隆进行测序,60个(60%)含有微卫星序列(GenBank Accession Number:DQ789247~DQ789306)。成功设计了47对鳜鱼微卫星引物,并合成21对引物进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记。结果表明:FIASCO法能有效提高筛选微卫星标记的效率。本研究筛选的微卫星标记可以用于鳜鱼遗传背景分析和遗传连锁图谱构建,并将为鳜鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状位点(QTL)基因的定位等研究提供候选微卫星标记。     

鳜淋巴器官的个体发育

运用连续石蜡切片技术和组织学观察方法,对常规孵化出膜后1～33日龄鳜(Siniperca chuatsi)淋巴器官个体发育过程的组织学特点进行研究。结果表明,水温23～25℃时,出膜后第4天,部分仔鱼开始摄食并逐渐转入外源性营养阶段。同样水温条件下,出膜后第3天,出现胸腺原基,然后胸腺迅速淋巴化,能明显分为外区、中区和内区。鳜在出膜时已存在原肾管,原肾管前部分发育为头肾原基,由一些造血干细胞和肾小管组成;后部分发育为中肾和后肾,主要由肾小管组成。随着个体发育,头肾的淋巴细胞数量增多,肾小管数量减少,头肾逐渐由排泄器官转化为淋巴器官。出膜后第5天,观察到脾脏原基,脾脏主要由造血细胞和淋巴细胞组成,淋巴化速度较慢。至出膜后30天左右,体形和淋巴器官的发育情况基本与成鱼相似。鳜淋巴器官原基出现的顺序是头肾、胸腺、脾脏;而这些器官淋巴化的顺序是胸腺、头肾和脾脏。     

翘嘴鳜人工雌核发育的初步研究

采用紫外线照射灭活精子,经冷休克诱导染色体加倍的方法对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)进行人工诱导雌核发育育种。灭活翘嘴鳜精子,紫外线照射剂量80 mJ/cm2是最佳的辐射剂量。冷休克结果表明,在0～3℃冰水下,冷休克起始时间为授精后3～7 min均有效,以5 min为最适;冷休克持续时间10-50 min均有效,以30 min最佳。综合以上两项因素,授精5 min后,休克时间持续30 min组的原肠胚存活率和孵化率均为最高,与其他处理组差异显著(P<0.05),此时雌核发育率最高,达到4.72%。     

湖泊套养鳜鱼试验

1998年，在沅江市白沙乡八形汊场的上湖（160hm^2)进行了套养鳜鱼与下湖（140hm^2)未套养鳜鱼的对比试验。结果，上湖平均鲜鱼产量2810．6kg/hm^2，比下湖的2915．7kg/hm^2低105．1kg/hm^2，但上湖的产值、利润、投入产出比分别为17973．75元/hm^2、8863．13元/hm^2、1：1．97，依次分别比下湖的11496．43元/hm^2、4813．57元／hm^2、1：1．72高36．0％、45．7％、12．7％。     

鳜雌雄生长差异的研究

对雌、雄鳜主要可量性状及其生长速度进行比较研究表明:雌、雄鳜的体长/体高差异极显著,体重/体长差异显著,体长/头长、尾柄长/尾柄高、头长/吻长、头长/眼径之间无显著差异;在相同饲养条件下,体重170 g以内时,雌、雄鳜生长无显著差异;但从170 g到800 g雌鱼的生长速度明显地快于雄鱼;800 g以上雌鱼生长减慢,雄鱼生长开始快于雌鱼;1 kg以内的鳜雌大雄小,1 kg以上时一般雄大雌小。     

翘嘴鳜微卫星标记及其与主要经济性状的相关分析

利用筛选出的7对具有较高多态性的微卫星标记,检测106尾翘嘴鳜Siniperca chuatsi选育个体的基因组DNA,分析这些微卫星标记与翘嘴鳜体长、体质量和体高的相关性。结果获得67个等位基因,各位点的等位基因数为3~19,片段大小在147~530bp之间;期望杂合度0.5092~0.9207,均值为0.7574;各位点的多态信息含量在0.4639~0.9101之间,均值为0.7197,表明所选择的SSR标记识别力较高,适用于翘嘴鳜选育群体遗传分析和标记辅助育种研究。相关性分析结果表明,G4位点中含有的片段为219bp等位基因的基因型(229/219或219/219)个体的体质量、体长和体高的表型效应显著高于其他的基因型,G10位点中246/246基因型的体质量和体高表型效应显著高于其他基因型,可作为未来翘嘴鳜分子标记辅助育种的重要参考位点。     

江苏省6个翘嘴鳜群体的遗传多样性分析

利用20对微卫星引物对江苏省5个内陆湖(太湖、滆湖、洪泽湖、高邮湖和骆马湖)和长江的翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)野生种群进行遗传多样性分析,研究江苏省不同水域翘嘴鳜的遗传多样性差异和亲缘关系。结果表明,6个水域的翘嘴鳜群体遗传多样性丰富,其中长江翘嘴鳜群体的平均有效等位基因数为6. 524 8,平均期望杂合度为0. 922,平均多态信息含量为0. 827 3,均高于其它5个翘嘴鳜群体,说明长江翘嘴鳜群体的遗传多样性高于其它5湖的翘嘴鳜群体。哈迪温伯格平衡显示,只有2个位点上存在不平衡,其余都满足哈迪温伯格平衡。从6个水域翘嘴鳜群体之间的遗传相似系数和遗传距离来看,太湖翘嘴鳜群体和滆湖翘嘴鳜群体的亲缘关系最近,骆马湖翘嘴鳜群体和太湖翘嘴鳜群体的亲缘关系最远。研究结果可为江苏省翘嘴鳜种质资源的保护、监测和遗传育种提供分子基础资料。