维氏气单胞菌研究进展

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）渐已成为重要的人-鱼共患致病菌。文章简单介绍了其分类地位及常规和特殊的生物学性质,并进一步综述了该菌的毒力因子、鉴定方法、流行病学和疫苗研究。作为气单胞菌属的成员,维氏气单胞菌具有该属典型的毒力因子,如气溶素、肠毒素、一系列粘附因子、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶和核酸酶等。目前,维氏气单胞菌的鉴定主要依靠生理生化方法,也有人应用分子生物学和免疫学方法鉴定。维氏气单胞菌对水产动物有相当高的致死率,患有肝胆疾病的人感染后常常产生严重的后果,需要加强针对该菌所致疾病的诊断。在疫苗研究方面,有学者研究了口服疫苗和DNA疫苗,达到了一定的免疫效果。     

框镜鲤致病性维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测框镜鲤致病性维氏气单胞菌(A.veronii)双重PCR方法,本研究以A.veronii CY0806株和国际标准株DNA为模板,分别以16S rRNA和Aer基因特异性引物进行PCR扩增,分别获得大小约880 bp和430 bp的DNA片段。通过序列比对分析,16S rRNA基因片段、Aer片段序列与GenBank中登录的A.veronii ATCC35624株的的同源性均为99%。进一步试验显示该方法的敏感性较高,达到1.58×10-3ng/μL,特异性较强,只有A.veronii标准株及分离株结果呈阳性;人工模拟污染样本试验显示:该方法的检出率达到了86.7%,高于细菌分离培养的70%检出率。双重PCR检测方法的建立,为框镜鲤致病性A.veronii的检测提供新的方法。     

水生动物维氏气单胞菌病概述

文章从维氏气单胞菌病的病原、临床症状、病理变化、诊断及防治方面进行概述,为该病的防治提供参考。     

鱼源维氏气单胞菌的耐药性研究

为检测7株鱼源维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的耐药基因和耐药表型的分布情况,试验采用PCR法检测分离株中氨基糖苷类耐药基因(aac(3)-Ⅱa、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰa和aph(3')-Ⅱa),磺胺类耐药基因(Sul1、Sul2和Sul3)和四环素类耐药基因(tetA、tetC和tetM),运用Kirby-Bauer纸片扩散法检测7株鱼源维氏气单胞菌分离株对22种常用抗生素的敏感性。结果表明,可检出耐药基因aac(3)-Ⅱa(71.4%)、aac(6')-Ⅰb(85.7%)、Sul2(85.7%)和tetA(28.5%);未检出ant(3")-Ⅰa、aph(3')-Ⅱa、Sul1、Sul3、tetC和tetM基因。7株维氏气单胞菌对磷霉素(100%)、多黏霉素B(100%)、痢特灵(85.7%)、奥复星(71.4%)较敏感;对氨苄西林(100%)、乙酰螺旋霉素(100%)、复方新诺明(85.7%)、磺胺异恶唑(85.7%)、四环素(85.7%)等耐药。这说明耐药基因和耐药表型之间存在一定的相关性。     

维氏气单胞菌生物膜体外模型的建立及影响因素的研究

为探索不同理化因素对致病性维氏气单胞菌(Aeramonasveronii,AV)‘TH0426成膜的影响,采用改良微孔板法建立致病性AV生物膜体外模型并对其进行了研究。结果表明,AVTH0426能够在聚乙烯酶标板表面形成生物膜,PH值4~6,10℃和NaCl浓度4 g/L培养18 h是形成生物膜的最适条件,黄颡鱼(Pseudobagrusfulvidraco)的肝脏提取液对AV TH0426形成生物膜有促进作用。这为进一步探讨维氏气单胞菌生物膜形成机制和致病机理提供了参考。     

维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA的克隆及原核表达

本试验旨在利用大肠杆菌BL21（DE3）表达维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性。根据GenBank公布的序列设计1对引物,经PCR扩增获得flaA基因的完整开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达和纯化。SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌成功表达,约在38 ku处可见清晰的表达产物,诱导产物大小与理论值相符。经Western blotting检测,结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体和His-tag抗体发生免疫反应。因此,本试验成功表达了维氏气单胞菌鞭毛蛋白flaA,为进一步研究其生物学功能及免疫佐剂作用奠定了基础。     

1株鲫源维氏气单胞菌的分离鉴定

为快速分离鉴定鲫鱼出血性败血症致病因子,从病死鲫鱼肝脏分离细菌,经LB固体培养基划线分离,28℃,24 h培养后,见圆润光滑、表面微凸的菌株呈优势生长,挑取单菌落命名为AX002。观察该菌在RYAN培养基28℃,24 h后生长成深绿色有深核菌落,同条件在RS培养基培养,24 h后长成黄色菌落,后逐步由内向外变为绿色菌落,通过全自动细菌鉴定系统,检测AX002对蔗糖等23种指标呈阳性反应,对山梨醇等22种指标呈阴性反应。设计引物扩增16S r DNA和促旋酶亚基(gyr B)基因并测序。测序结果与NCBI中其他菌株序列进行比对,建立系统发育树,确定AX002为维氏气单胞菌。同时该系统显示该菌对阿米卡星、头孢唑啉、复方新诺明、环丙沙星等15种抗生素敏感。该菌对头孢唑啉、氨苄西林和氨苄西林舒巴坦钠三中抗生素药物最低抑菌浓度>16μg/m L,对四环素最低抑菌浓度>8μg/m L,结果判定AX002对头孢唑啉、氨苄西林、氨苄西林舒巴坦钠和四环素具有耐药性。该菌对体长5~15 cm,体重30~50 g鲫鱼腹腔注射,测定半致死浓度(LD50)为2.38×107CFU/m L。本研究有利于进一步研究维氏气单胞菌。     

牦牛源维氏气单胞菌的分离鉴定

四川省阿坝藏族羌族自治州某牧场牦牛发生腹泻和肝脏肿大为特征的疾病,本实验的目的是对病料进行细菌的分离鉴定.采集2头病死牛鼻拭子、肛拭子及肝脏样本进行细菌分离,采用16SrRNA基因和gyrB基因的序列测定鉴定细菌种,从6份病死牛样本中分离到6株维氏气单胞菌.分离菌对小鼠有较强的致病性,能导致小鼠肺脏出血和小肠肿胀出血;...     

一株草鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了鉴定贵州芩巩县某养殖场草鱼发病死亡的病原,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定、药敏试验、动物回归试验、16S rDNA与gyr B基因测序及系统分析进行鉴定。结果显示,本研究从发病草鱼体内分离到1株致病菌GZQG2019,分离菌在培养基中呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围呈现β-溶血环;革兰氏镜检显示,分离菌呈两端钝圆短小阴性杆菌;16S rDNA、gyr B基因序列分析显示,分离菌与维氏气单胞菌聚为一支,同源性均在99%以上;药敏试验结果显示,在使用的20种抗菌药物中,该菌对四环素、丁胺卡那、多黏菌素B和头孢曲松等10种药物敏感,对苯唑西林、青霉素、阿莫西林和庆大霉素等8种药物中度敏感,对头孢氨苄、复方新诺明2种药物耐药;动物回归试验显示,该菌对健康草鱼具有强致病性;10种毒力基因扩增结果显示,分离菌携带气溶素、热不稳定性肠毒素、溶血素、核酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和酯酶7种毒力基因。本试验成功分离到1株草鱼源维氏气单胞菌,具有较强毒力,且携带多种毒力因子;对四环素、丁胺卡那等药物敏感,对四环素、丁胺卡那等耐药,为维氏气单胞菌病临床用药提供参考依据。     

维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

为证明维氏气单胞菌灭活疫苗对锦鲤机体的免疫效果,应用福尔马林灭活法制备了维氏气单胞菌灭活疫苗对免疫后的锦鲤进行酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等各项免疫指标的检测,并于试验第5周进行免疫保护力试验。结果显示,酸性磷酸酶活力在试验开始后有所上升,在第2周达到最高;超氧化物歧化酶活力上升,并在第2周达到最高;经观察,第3周开始白细胞的数量增多,吞噬活性同时增大;抗体效价于第3周达到最大值,并持续一段时间;免疫4周后攻菌检测免疫保护力,测得试验组的相对免疫保护率RPS为86.4%。上述结果表明,维氏气单胞菌灭活疫苗能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应,并能形成一定保护力。     

致病性嗜水气单胞菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank已登录的致病性嗜水气单胞菌保守序列16S rDNA和Aero,设计2对引物,以嗜水气单胞菌纯培养物为起始材料,建立PCR检测方法。从12株分离物中均扩增到16S rDNA片段,从3株分离物中均扩增到Aero片段,经序列测定和分析,所扩增的片段均为嗜水气单胞菌的核苷酸序列。结果表明,建立的PCR方法可用于检测致病性嗜水气单胞菌。     

聚合酶链反应(PCR)法检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因

根据已报道的鱼源嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列设计和合成了 1对可扩增目的片段长度为 893bp的引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因 PCR方法。脱脂奶平板产溶蛋白圈的 10株鱼源嗜水气单胞菌株以及 ATCC796 6检测均为阳性 ,检测的灵敏度可达 2 .0× 10 - 3g/ L的模板 DNA。表明 PCR法在分子水平快速、特异检测嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶并可作为流行病学调查的手段     

猪增生性肠炎套式PCR检测方法的建立及初步应用

本试验旨在建立检测猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)的套式PCR方法,为临床快速鉴别诊断和防控该病提供病原学依据。根据GenBank上已发表的的劳森氏胞内菌(Lawsonia intracellularis,LI)的基因组序列（登录号：AM180252）设计2对特异性引物,以疑似PPE病猪粪便中纯化的DNA为模板,建立了套式PCR方法,并对PCR产物进行序列测定,所扩增的序列与GenBank上登录的劳森氏胞内菌相应序列的同源性在99%以上。应用本试验建立的套式PCR方法对疑似PPE病猪的粪便进行检测,结果表明,本方法具有快速、方便和敏感度高等优点,可用于PPE的临床检测。     

猪伪狂犬病PCR检测方法的建立与应用

根据Genbank中PRV gD基因序列设计引物建立了检测猪场狂犬病的PCR方法并对某省25份猪伪狂犬病疑似病料进行检测，结果在2S份病料中，检出伪狂犬阳性病料7份，阳性率接近30%。通过检测结果及特异性和敏感性实验发现此检测方法敏感度很高。这种检测方法适合科学研究、临床诊断以及流行病学调查。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR快速检测方法的建立及应用

参考GeneBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为387bp的目的基因片段,优化PCR反应条件,建立了兔支气管败血波氏杆菌的PCR快速检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和巴氏杆菌均无交叉反应,且检出最低浓度为10pg,可用于临床检测。     

支原体PCR检测方法的建立和应用

依据GenBank中登录的常见细胞污染支原体16S rRNA基因序列,选择高度保守的区域设计引物,建立了一种快速灵敏的支原体PCR检测方法.该方法可以特异性检测出6种支原体,并能敏感的检测到10个拷贝数的目的基因.采用建立的PCR方法和传统的培养法对23个不同样品(细胞、血清、疫苗成品、半成品)进行检测,符合度100％.该方法的建立可大大缩短疫苗生产过程中支原体检验所需时间.     

流产衣原体TaqMan实时荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

流产衣原体是导致绵羊地方性流产的主要病原体，给全球畜牧业经济发展构成了巨大威胁。为建立一种灵敏、特异且快速的检测流产衣原体的实时荧光定量PCR方法，依据衣原体蛋白酶样活性因子的基因组序列设计了针对检测流产衣原体的引物和TaqMan探针，对反应体系和反应条件进行了优化，对方法的灵敏度、特异性及重复性进行了评价，并初步应用于临床样本检测。结果显示，该方法的最低检测限为26 copies/μL，灵敏度是普通PCR的10倍；与其他可以引起类似症状的病原体无交叉反应；组内和组间变异系数均小于3%；对156份流产羊拭子的基因组进行检测，检出率为78.21%。研究表明，该方法可以很好的应用于流产衣原体的大规模临床样本检测，为流产衣原体病的高通量检测和流行病学调查提供技术手段。     

鸭圆环病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

鸭圆环病毒病给养鸭业造成严重的经济损失,鉴于此,本研究根据GenBank登录的鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)保守区基因组序列(登录号:NC_005053.1),设计合成内、外2对引物,通过PCR反应条件的优化,建立了检测DuCV的巢式PCR检测方法。该方法对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、新城疫病毒的扩增结果均为阴性;第1轮扩增的灵敏度为10 pg,第2轮扩增的灵敏度为0.1 pg,通过巢式PCR,敏感性提高了100倍。本研究建立的巢式PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可以准确快速的用于鸭圆环病毒的病原检测。     

A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据WHO推荐的检测A型猪流感病毒的引物和探针序列,建立了A型猪流感病毒实时荧光定量PCR检测方法。使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,检测结果表明,该方法的敏感性可达100拷贝/25μL反应体系,显示出良好的敏感性和重复性,临床上已用于实验室鼻拭子样品的检测,并成为一种快速定量检测A型猪流感病毒的方法。     

沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测.