内含肽介导的蛋白质环化研究进展

内含肽介导的蛋白质主链骨架环化是一种稳定蛋白质的新方法。在内含肽的作用下,蛋白质的N端和C端生成一个天然的肽键,达到蛋白质环化的目的。环化可以减小蛋白质构象的熵值,从而使蛋白质更加稳定。蛋白质环化的方法为生产稳定药物蛋白质和工业酶提供了一种新的手段。     

内含肽的研究及应用进展

对内含肽与内含子之间的差异进行了比较,概述了内含肽的种类和自我剪接机制,着重阐述了内含肽在当前各生物技术领域中的应用,分析了其优点和局限性,最后对内含肽的应用方向进行了展望。     

低能氩离子束介导将绿色荧光蛋白基因导入小麦的研究

用低能氩离子束介导将改良的绿色荧光蛋白基因（ｍＧＦＰ４）导入小麦栽培品种皖９２１０和皖麦３２号的成熟胚细胞。在含有１００￣１４０ｍ／Ｌ巴龙霉素培养基上继代培养后,获得了一批抗性愈伤组织。经过分化培养,皖９２１０获得５株再生苗,皖麦３２号获得３２株绿苗,对照的２００枚成熟胚未获得再生苗。对再生苗进行ＰＣＲ检测,均扩增出６００ｂｐ的ｎｐｔⅡ基因片段。取４株长势好的绿苗进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,结果     

内含肽融合标签介导的人乙醛脱氢酶2基因原核表达

为获得高活性重组人乙醛脱氢酶2(ALDH2)重组蛋白,研究通过PCR获得ALDH2基因,先后构建克隆和表达载体p GEM-ALDH2和p TYB11-ALDH2。转化的阳性重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE显示融合蛋白获得大量表达。通过正交试验对表达条件优化设计,结果表明,诱导OD值0.3,30℃,IPTG浓度1.0 mmol·L-1,诱导表达4 h为最优表达条件。由于融合蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性,使用IMPACTTM-CN蛋白纯化系统,经内含肽标签蛋白自裂解洗脱、纯化,获得仅含有几个载体氨基酸的ALDH2蛋白,蛋白浓度为0.045 mg·m L-1。纯化的ALDH2蛋白比活力为462 U·mg-1。     

慢病毒载体介导成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白

 试验尝试建立稳定表达外源基因的人成纤维细胞系。取成年男性包皮皮肤的皮下组织,分离培养人皮肤成纤维细胞,分别采用脂质体和慢病毒载体介导转染人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。结果显示,来自成年人包皮皮下组织的成纤维细胞呈梭形,具有快速的增殖和稳定的生长性能。脂质体介导转染的人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白表达不稳定,阳性细胞表达率低,转染后的人成纤维细胞变得更为细长,细胞生长速度降低。慢病毒载体介导人皮肤成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白,转染后细胞生长性能和形态没有变化,经过多次传代和冻存复苏对人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白的表达没有影响,通过流式细胞仪对慢病毒介导表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞检测显示,绿色荧光蛋白表达阳性率为99.85%,并且表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞细胞均一程度为76.05%。试验证实了慢病毒载体能够高效稳定介导人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。     

基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法

细胞是生命活动的基本单位,各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法,其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法,包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等,同时对上述几种方法进行了比较分析。     

绿色荧光蛋白在植物上应用研究进展

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋生物多管水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的一种功能独特的生物发光蛋白。能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。随着进一步对绿色荧光蛋白结构及其发光特性的研究,以及对绿色荧光蛋白基因的成功克隆,对多种新型绿色荧光蛋白的成功改造,使对多种目标进行实时监测成为可能。文中综述了绿色荧光蛋白的发展过程、改进及应用的研究进展。     

绿色荧光蛋白及其应用的研究进展

来源于水母A equorea v ictoria的绿色荧光蛋白(green fluorescen t prote in,GFP)现已成为在生命科学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。就绿色荧光蛋白的特性及其在生命科学中应用的研究进展作了概述。     

蓝细菌分离DnaE内含肽的自我剪接研究

【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时,两段分离的dnaE序列被克隆到同一表达载体,构建双重组表达质粒,两段序列具有各自的ORF,但由同一启动子调控。双重组表达质粒经诱导之后,利用以上获得的抗体对含有内含肽的DnaE蛋白在大肠杆菌表达体系中的自我剪接反应进行检测。【结果】在双重组表达质粒的表达产物中,抗体不仅可以分别与对应的蛋白质反应,而且还可以同时识别1条新条带,该条带的表观分子量与成熟DnaE的理论值大致相符。【结论】蓝细菌分离的DnaE内含肽在大肠杆菌表达体系中可以进行自我剪接;本研究中获得的抗体具有较好的特异性,无明显背景干扰,而且效价高,抗体可以稀释1 000倍以上使用,也可以用于相关方面的研究。     

表达绿色荧光蛋白的猪胚胎生殖细胞分离

以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体，对处于快速增殖期的8株猪胚胎生殖(EG)细胞(4—9代)进行转基因试验。用1μg DNA和2μL LipofecTamine 2000转染EG细胞后，共获得4株转染EGFP基因的EG细胞系(EG—EGFP)，可发出强绿色荧光；EG—EGFP细胞连续培养2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG—EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中，共注射135枚胚胎，其中112枚存活并发育至囊胚(83．0％)；86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞，其中57枚囊胚在内细胞团(ICM)上发现有EG—EGFP细胞。     

表达绿色荧光蛋白重组单核细胞增多性李斯特菌的构建

将编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因融合到单核细胞增多性李斯特菌actA基因启动子和信号肽下游,应用同源重组技术构建了含gfp的重组李斯特菌突变株.PCR扩增及其产物的酶切鉴定均证实目的基因gfp融合到李斯特菌基因组中.荧光显微镜下可见重组菌体发绿色荧光.SDS-PAGE电泳和免疫印迹结果显示重组李斯特菌表达的GFP分子量约为28 kD,与预计的分子量大小一致.重组菌对鸡胚和小鼠的毒力以及对体外培养细胞的侵袭力均低于野生型李斯特菌.该重组菌可用于研究李斯特菌的致病机理和食品加工过程中微生物污染控制的指示性细菌.     

表达绿色荧光蛋白重组乳酸杆菌的构建及电击转化条件

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组乳酸杆菌．将pGFP2质粒中的绿色荧光蛋白基因切下,克隆进表达载体质粒pThioHisB的NcoⅠ和SacⅠ位点之间,构建成重组表达质粒pThaioGFP,然后转化大肠杆菌B121．从BL21中提取重组质粒,用电击法转化乳酸杆菌Lac1001,当细菌处于D600nm为0．6的生长期时,使用PEB作为电击缓冲液,对100μL体积的细胞悬液在电容25μF,电阻200Ω,电压2．2kV的电击条件进行完整质粒转化可得到较高的转化率．电击转化后Lacl001于LB培养基上呈绿色,在荧光透射仪下观察,整个菌体发绿色荧光．构建的重组乳酸杆菌能够稳定表达绿色荧光蛋白．     

雌激素调控的绿色荧光蛋白在酵母细胞中的表达

采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,用酵母细胞构建环境雌激素(EEH)的评价体系,可敏感、快速、方便地筛选出EEH化合物。通过分子生物学技术,将GFP基因插入到pM P 206/ERE启动子CYC 1的下游,用GFP取代L ac Z基因,并转化于酵母细胞。DNA测序发现ERE-CYC 1-GFP框架正确。对转化子进行PCR鉴定,发现有雌激素受体基因(hER cDNA)和GFP基因特异条带,说明hER cDNA和GFP已重组于酵母细胞。荧光显微镜下发现大量的绿色荧光颗粒,表明GFP基因在酵母细胞中成功表达。酵母细胞经不同浓度雌二醇作用后,与GFP表达量有剂量效应关系。与其他酵母评价体系相比,以GFP为报告基因评价EEH不需要破坏细胞壁,也不需要底物,可在96孔板中完成,这为高通量筛选EEH化合物奠定了基础。     

A minirhizotron imaging system to identify roots expressing the green fluorescent protein

The limited flexibility available in the configuration of commercial minirhizotron imaging systems makes it difficult to adapt these systems to new applications. It is also too expensive to introduce modifications, which are often very temporary to these systems at the end of the development process.In order to identify the roots of a single species in mixed plant stands, we developed a new minirhizotron imaging system that makes it possible to observe roots expressing green fluorescent protein (GFP). This system is based on affordable and easily obtainable components such as webcams. Here, we report a protocol to identify suitable webcams for constructing a minirhizotron imaging system and demonstrate the application of this protocol to build a minirhizotron imaging system that can identify the roots of a transformed maize plant expressing GFP.     

重组小麦组蛋白H4介导绿色荧光蛋白基因(pEGFP/C1)的转染

利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好地结合质粒DNA,且能有效地保护DNA分子不受核酸酶降解,并能高效地携带绿色荧光蛋白基因pEGFP/C1转染进入卵巢癌细胞株H08910。     

Expression and Purification of Recombinant MP-GFP Protein in Escherichia coli

Guided pesticide is an unique compound resulted from the conjugation with carrier (amino acid, protein, sugars, etc) and the active pesticide ingredient. One of the attributes of the guided pesticide is its potential to accumulate at the site of the damaged points caused by pest or at the site of entry to the target pests, such as via inhalation, cuticular penetration, and oral digestion. Movement protein (MP) is a kind of protein coded by plant virus. A genetic fusion between green fluorescent protein (GFP) and movement protein resulted in the expression of a fluorescent fusion MP-GFP protein, which was fully biologically active in mediating the cell-to-cell spread of virus. In order to obtain a suitable carrier for a pesticide,fluorescent carrier MP-GFP was constructed. It was found that the recombinant MP-GFP protein was the inclusion body.The results indicated that optimized cultural condition for expression of recombinant MP-GFP protein was incubation at 37℃ for 2 h and induction with 0.2 mmol L-1 IPTG (isopropyl-β-dthiogalactopyranoside) at 25℃ for 4 h. MP-GFP protein was purified by using Ni-NTA resin. The expressed recombinant MP-GFP protein had both the fluorescence character of report GFP gene and moving character of movement protein. It could provide a guided carrier for studying the guided pesticide. It could also provide convenience for studying the delivery and distribution of the guided pesticide ingredients in the plant.     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。