蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建及其在牛乳腺中的表达

将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,转染泌乳期奶牛乳腺小叶并获得暂时表达。利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织,产后奶样经FAPA法检测表明蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织,并能实现相对稳定的表达。     

蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体构建与检测

利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中.     

抗菌肽重组逆转录病毒载体的构建、重组病毒的包装及其在牛奶中的稳定表达

将含有双抗菌肽基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLN-bcp-LK(R)中,获得了含有双抗菌肽基因的重组逆转录病毒载体pLN-bcp-LfcinB-CE-MA(R),利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,用病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL,用病毒上清转染妊娠中后期奶牛乳腺组织,产犊后采集的奶样经琼脂板溶圈法和Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明乳汁中表达的抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显地抑菌活性,并能实现相对稳定的表达,表达可持续30~45 d。     

蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R的构建及其在奶牛乳腺组织中的表达

构建含有蚓激酶基因(Lumbrokinase,LK)cDNA的重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R,以200μg、500μg、1000μg、2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,转染泌乳期奶牛乳腺组织获得暂时表达,并以500μg为最佳表达剂量。利用脂质体转染PA317包装细胞,通过G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后收集病毒上清感染NIH_3T_3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×10~4CFU/mL。再用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织,产后奶样经FAPA法检测蚓激酶活性,结果表明牛奶具有明显的纤溶活性,即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织并能实现相对稳定的表达。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

布鲁菌真核表达载体pVAX1-L7/L12-Omp31的构建及鉴定

根据Gen Bank中的布鲁菌核糖体蛋白L7/L12和外膜蛋白Omp31的基因序列设计引物,用重叠延伸PCR方法扩增融合基因,将基因克隆至p VAX1载体,构建p VAX1-L7/L12-Omp31重组质粒。采用脂质体转染的方法,将融合质粒转入Vero细胞中,用间接免疫荧光法和Western blotting检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果显示:转染48 h后,融合基因蛋白在细胞内高效表达,为研究融合质粒在布鲁氏菌病动物模型中的免疫效果奠定了基础。     

猪TREX1基因的真核表达及其在JEV感染中的作用研究

为了明确猪TREX1在JEV感染中的作用,本研究利用PCR扩增获得猪TREX1基因的ORF,并将该基因克隆至真核表达载体p3xFlag-CMV-14中,将构建的重组真核表达质粒命名为pFlag-pTREX1,利用lipofectamine 2000将构建成功的pFlag-pTREX1重组质粒瞬时转染至293T细胞中,通...     

A群轮状病毒NSP5蛋白在细胞器中定位特性

为研究A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP5在MA-104细胞中的定位情况,本研究将NSP5蛋白基因克隆于表达载体p EGFP-C2中构建重组质粒p EGFP-NSP5,将其转染于MA-104细胞中进行NSP5瞬时表达,并于转染48 h后利用激光共聚焦显微镜分析NSP5表达蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,表达蛋白在MA-104细胞中的线粒体、内质网、高尔基体中均有分布,主要定位于细胞质。本研究为进一步分析病毒的复制和致病机理提供依据。     

miR-16逆转录病毒载体的构建与表达检测

为了探明miR16在体细胞重编程过程中的作用机制,构建小鼠miR-16逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR16的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR-16核心序列并将其连接到p MD18-simple载体,对重组质粒进行双酶切回收目的片段。将目的片段与p MXs逆转录病毒载体连接,经过酶切、PCR和测序鉴定,最终构建逆转录病毒载体miR16-p MXs;采用脂质体法将miR16-p MXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,反转录后获得cDNA,并采用q PCR方法检测侵染前后细胞中miR-16的相对表达量。结果显示,被逆转录病毒侵染后,小鼠成纤维细胞中miR-16的相对表达量比侵染前约提高1 460倍。结论:成功构建具有表达活性的microRNA16逆转录病毒载体,为进一步开展miR-16在细胞重编程中的作用机制的相关研究提供了依据。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。     

重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦ ＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。     

共表达内溶素和人溶菌酶基因的重组腺病毒构建

为研究内溶素SAL-2和人溶菌酶h LYZ的联合抑菌作用,本研究通过PCR方法分别从携带SAL-2和h LYZ基因的质粒中扩增目的片段,连接至腺病毒穿梭载体的多克隆位点上,构建重组穿梭载体p Shuttle-SAL和p Shuttle-LYZ。成功构建的重组穿梭质粒与Ad-easy骨架质粒在BJ5183中发生同源重组,重组得到的阳性重组腺病毒载体在脂质体介导下转染HEK293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SALLYZ和对照重组腺病毒Ad-GFP,通过RT-PCR和Western blot方法检测mR NA和蛋白表达后,将构建的重组腺病毒进行扩增纯化并测定病毒滴度。结果表明,成功构建的重组腺病毒感染细胞后,SAL-2和h LYZ基因的mR NA均有表达,Western blot分别检测到28.6 ku和14.7 ku目的蛋白条带。扩增纯化后经TCID50方法检测病毒滴度分别为108.17TCID50/mL、108.50TCID50/mL、108.63TCID50/mL和107.60TCID50/mL。表明成功构建包装的重组腺病毒对HEK293细胞具有较强的感染能力,可稳定介导SAL-2基因和h LYZ基因在HEK293细胞中的表达。     

靶向绵羊MSTN基因的锌指核酸酶腺病毒表达载体的构建及活性验证

旨在构建并包装打靶绵羊MSTN基因的位点特异性锌指核酸酶腺病毒表达载体,以借助腺病毒的高转染效率和非整合性以及锌指核酸酶的高效性和特异性实现对绵羊MSTN基因的敲除。本研究利用PCR扩增T2A序列和锌指核酸酶异源二聚体序列,测序鉴定后依次克隆至pAdTrack-CMV,得到pAdTrack-ZFNL-T2A-ZFNR穿梭载体,将之与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转染至BJ5183菌株进行同源重组,以构建pAdEasy-ZFNL-T2A-ZFNR表达载体。然后用上述表达载体转染HEK293细胞进行重组腺病毒的包装,将PCR鉴定阳性的病毒进行扩增并测定病毒滴度。侵染绵羊胎儿成纤维细胞检测重组腺病毒对靶细胞的侵染能力,并用Western blot方法检测绵羊胎儿成纤维细胞中ZFN的表达,进而在细胞水平验证ZFN的活性。结果,包装得到的锌指核酸酶重组腺病毒能够高效侵染绵羊胎儿成纤维细胞并表达ZFN,腺病毒介导的ZFN可识别并切割绵羊MSTN基因。本研究成功获得靶向识别并切割绵羊MSTN基因的锌指核酸酶重组腺病毒。     

口蹄疫病毒VP1基因siRNA重组腺病毒的构建及其介导的RNAi抑制口蹄疫病毒复制的研究

本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。     

敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体的构建及在成纤维细胞中的表达

为了构建敖汉细毛羊Hoxa7基因表达载体以及研究表达载体转染成纤维细胞后基因表达量的变化,试验从40日龄敖汉细毛羊肩部皮肤提取RNA并反转录成cDNA,参照GenBank中Hoxa7基因的CDS区序列设计1对引物;将PCR扩增获取的Hoxa7基因CDS片段连接到pEASYTM-T1载体上,构建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆载体,将克隆载体转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;从pEASYTM-T1载体上切下Hoxa7基因片段,连接到pcDNA3.1表达载体上,再次转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中;将重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7瞬时转染到传代的成纤维细胞中,利用实时荧光定量PCR技术、Western-blot方法检测成纤维细胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达情况。结果表明:重组表达载体pcDNA3.1-Hoxa7构建成功;瞬时转染到成纤维细胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表达量均极显著升高(P0.01)。说明敖汉细毛羊Hoxa7基因在成纤维细胞中能够高效表达。     

猪源IFN-λ3的克隆、表达及抗病毒活性分析

为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析p IFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行p IFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。     

逆转录病毒载体及其在动物病毒病的研究进展

逆转录病毒系统由于其病毒的高感染效率,在RNA干扰中的应用越来越多,在对基因功能的研究中起了很大的作用.逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,由逆转录病毒载体、包膜蛋白载体和包装细胞系组成.逆转录病毒载体具有基因组结构简单,便于基因操作、转染效率高、容量较大、宿主范围广、易于分离等优点,在外源基因表达、基因...     

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。