猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）序列设计并合了26条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT－PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆和测序，构建了C株全基因组cDNA文库，采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CSF C株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础。     

中国猪瘟兔化弱毒兔脾组织毒部分基因序列分析

利用反转录（ＲＴ）及套式ＰＣＲ（Ｎ－ＰＣＲ）方法,获得了中国猪瘟兔化弱毒（ＨＣＬＶ）兔脾组织毒５１１０个碱基（２２４０－７３５０）扩增片段,包括其结构蛋白基因ｇｐ５５和非结构蛋白基因ｐ５４及ｐ８０将其克隆也测序载体中,通过测序确定了这些基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。     

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对12批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒，以RT-PCR获得了E2基因的主要编码区的大约250bp大小的节片，在DNAstar上对这些节片的211pb进行了测序，观察到这些节片的编码序列高度同源性，其核苷酸序列和氨基酸序列有98.1%-100%相同，其中9批完全一致，结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。     

猪瘟兔化弱毒疫苗的临床试验

1效力 用我国生产的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗免疫无猪瘟抗体及抗原的易感猪，每头皮下注射1头份，14天后分别攻击猪瘟野毒，每头皮下注射猪瘟血毒2毫升。结果表明，猪瘟弱毒细胞苗对9株野毒均具有坚强的保护力，免疫组100％保护，对照组76．5％死亡。以猪瘟荧光抗体法（HCFA）检查，     

猪瘟兔化弱毒毒种保存期试验

本试验对３个代次不同冻干日期的猪瘟兔化弱毒进行了兔体最小感染量测定,并对经猪瘟兔化弱毒Ｆ４７６代毒繁殖冻干的两批猪瘟兔化弱毒Ｆ４７９代毒进行了免疫原性鉴定。结果表明,猪瘟兔化弱毒在－７０℃条件下保存１４年、１５年、２９年,其兔体最小感染量均无明显改变;繁殖的两批猪瘟兔化弱毒的最小免疫量均为１０＾－５稀释１ｍｌ,符合《兽用生物制品规程》规定。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA，根据已报道的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR)及测序技术，对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNAstar软件比较分析了5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株（C－ST株）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现，5株野毒与C－ST株核苷酸序列的同源性为81．7％－83．1％，氨基酸同源性为87．3％－88．6％，表明它们之间存在较大的差异；但5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达98．8％－99．3％，氨基酸同源性为96．6％－99．2％，表明它们之间的差异较小。     

中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究

采用终点稀释单细胞微量培养法对中国株猪瘟哆化弱毒（Ｃ株）进行克隆，获１０个克隆株；保持原Ｃ株的免疫原性和其他优良特性；在某些方面并有所提高。随机取６号克隆毒（Ｃ６）进行系列试验，结果表明：（１）对牛睾丸细胞敏感，共收毒批次和合格批次为１５／１９（７９．９％）（２）用兔增殖毒共归兔６４只，发率为９０．６％，用睾丸细胞增殖毒对３８只兔热反应率为８９．４７％，（３）按“规程”安检和增大一倍量对猪均无不良     

猪瘟兔化弱毒疫苗的研究概况

猪瘟病毒兔化弱毒株因其优良的免疫原性,成为我国至今唯一使用的猪瘟疫苗株。本文就猪瘟兔化弱毒株的生物学特性、猪瘟兔化弱毒组织疫苗和细胞疫苗的研制以及疫苗的应用进行了综述。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

反向遗传操作技术在猪瘟基础理论研究中的应用

反向遗传操作技术的问世为RNA病毒的研究铺平了道路,研究人员根据需要在DNA水平上对RNA病毒进行加工和修饰,进而深入研究RNA病毒的本质和开发新产品。自反向遗传操作技术在猪瘟病毒上应用以来,在对猪瘟病毒致病机理、分子表达调控机制、细胞生长特性、毒力决定基因等方面的研究已取得明显进展。本文就反向遗传操作技术在猪瘟病毒基础理论研究中的应用作一综述,通过了解病毒基因组的功能、病毒与宿主致病力的关系以及病毒增殖特性等,为研究开发理想猪瘟标记疫苗开拓思路。     

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法.     

山西猪瘟野毒株E_2基因序列测定与遗传变异多样性分析

为了解山西地区猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法,2013年从山西部分地区分离出5株CSFV流行毒株,并进行了E2全基因扩增、克隆与序列测定,应用DNAStar分析软件对所测定的5株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析,绘制系统发育进化树。结果表明：5株CSFV流行毒株之间E2基因核苷酸序列与所推导氨基酸序列的同源性分别为81.4%~100%和87.9%~100%,与CSFV石门毒株（Shimen株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.9%~94.8%和89.0%~94.9%,与CSFV兔化弱毒株（HCLV株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.6%~99.6%和87.9%~99.5%,与17株来自各国不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.5%~99.6%和86.3%~99.7%。经系统发育关系分析,4株属于基因2群,且705、713、725、729、734和738位氨基酸发生置换,另外1株属于基因1群。本研究揭示了山西猪瘟流行毒株的遗传变异多样性现状。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D)，根据中和特性和保守性差异，将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区，A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体，对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达，并分析表达产物的免疫反应性。研究发现：EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合，且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明：A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

猪瘟病毒感染致外周免疫器官损伤的病理组织学观察

将10头28日龄健康仔猪随机分成2组,其中感染组8头,对照组2头。感染组按1 mL/头颈部肌注猪瘟病毒(CSFV)石门株血毒(104TCID50/mL)进行人工感染,对照组不做任何处理。2 d后感染组仔猪体温升至40~41.5℃,稽留不退,而对照组体温正常。采集体温升高的仔猪扁桃体,运用RT-PCR方法检测,结果CSFV均为阳性,表明人工感染CSFV成功。分别于感染后4,7 d剖杀感染组和对照组仔猪各1头,剖解后观察各器官大体病变并采集脾脏和淋巴结等外周免疫器官制作石蜡切片,观察病理组织学变化;其余感染组仔猪分别于感染后13,16(2头),19,23,31 d自然死亡,死亡后按剖杀猪方法同样处理。组织学观察显示:随着病情的发展,感染组仔猪的脾脏和淋巴结的淋巴滤泡逐渐发生萎缩、甚至消失,脾脏的动脉周围淋巴鞘、淋巴结的副皮质区细胞亦逐渐减少坏死,即造成了T、B淋巴细胞的渐进性减少,而对照组无异常变化。结果表明:CSFV感染仔猪后,可引起脾脏淋巴结的淋巴细胞渐进性变性与坏死,造成免疫损伤。