苏云金杆菌HBF-1菌株的活芽孢对HD-1菌株增效作用的特异性

通过HBF-1菌株培养物各组分与HD-1菌株混合对棉铃虫的LC∞测定结果表明，HBF-1孢晶混合物对HD-1的纯晶体和孢晶混合物分别增效170．0％、80．0％，HBF-1活芽孢对HD-1的纯晶体和孢晶混合物分别增效240．0％、160．0％，HBF-1纯晶体和死芽孢均无增效作用。在一定范围内，随着HBF-1菌株活芽孢浓度的增高，其增效作用逐步提高，HBF-1活芽孢浓度为100μg／g时对棉铃虫的增效作用最大，使其死亡率提高了40．0％；HBF-1活芽孢浓度为50μg／g时对小菜蛾的增效作用最大，使其死亡率提高了47．0％。     

苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株防治金龟科幼虫的效果评价

以我国筛选出的对金龟科幼虫具有杀虫活性的HBF-1菌株为供试菌株，采用菌悬液与含有土豆丝的土壤混合饲喂幼虫的方法，测定了HBF-1菌株孢晶粉剂对华北地区主要金龟子幼虫的毒力，其敏感性依次为四纹丽金龟Popillia quadriguttata、黄褐丽金龟Anomala exoleta、蒙古丽全龟A．mongolica、铜绿丽金龟A．corpulenta和苹毛丽金龟Proagopertha lucidula，LC50为3．104、18．987、30．924、34．713和55．995μg／s土。HBF-1菌株悬浮剂防治花生田金龟子幼虫的田间小区试验结果表明，50倍液的虫口减退率为71．4％～75．4％，保果效果为58．7％～72．9％。在花生产量比较试验中，HBF-1菌株悬浮剂50倍液处理区比空白对照区的产量增加363．0—903．0kg／hm^2。HBF-1菌株悬浮剂施入草坪后可免受阳光中紫外线的照射，杀虫活性保持较长时间；经调查，HBF-1制剂在土壤中经过120天后仍保持杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌HBF-1芽孢对棉铃虫幼虫生长发育及酶活的影响

苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株的芽孢对初孵棉铃虫幼虫无明显杀伤作用,但可以直接影响其正常的生长发育,使幼虫前期体重增加;而后期发育迟缓,历期延长,成虫产卵量明显减少。通过光学显微镜观察发现,用含有HBF-1芽孢的饲料饲喂棉铃虫幼虫,幼虫中肠肠壁细胞遭到破坏;随着虫龄的增大,微绒毛逐渐脱落,有的部位细胞壁破裂。酶活的测定结果表明:初孵棉铃虫幼虫取食含有HBF-1芽孢(100μg/g)的饲料后,幼虫体内的乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性发生了变化。     

苏云金杆菌新菌株对金龟子幼虫的毒力比较

金龟子类幼虫是一类重要的地下害虫,可危害农、林、果、菜、草等多种植物。由于这类害虫危害植物地下部分或地面附近根茎部分,具有一定的隐蔽性,而且分布广,也是难以防治的世界性害虫。随着人们对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,以下简称Bt)资源调查与研究的深入,新的具有特异杀虫谱的Bt菌株陆续被发现。1992年,Ohba等在世界上首次从土壤中分离筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的Bt新菌株BuiBui。笔者于     

对小菜蛾高毒的苏云金杆菌菌株筛选试验初报

从田间自然死亡的小菜蛾虫尸中分离到Ｂ．ｔ．９４１９茵株，经复壮选育及摇瓶考核，在自选培养基上生长良好，２４ｈ孢子开始脱落形成晶体，３６ｈ全部形成晶体。晶体大、宽棱形、角尖。４８ｈ发酵液含菌量为３５亿／ｍＬ。经发酵液对小菜蛾毒力测定，４８ｈＬＣ_５０：对照ＨＤ－１含菌量为２７４ｍＬ／Ｌ，而９４１９仅１２４ｍＬ／Ｌ。     

苏云金杆菌不同菌株混合发酵对发酵效价和蛋白含量的影响

采用5种不同苏云金杆菌菌株进行了菌株交叉混合摇瓶发酵试验和一种组合2．3t发酵罐中试,以及两个优势组合在不同氮源培养基上的混合发酵试验。摇瓶试验获得两个优势组合为GC—91 58和94004 94001,其发酵效价分别为6476和6071IU/μl,晶体蛋白含量分别为0．526％和0．577％。发酵效价分别比GC—91纯培养提高50％和40％,晶体蛋白含量分别比GC—91纯培养提高24％和36％。两种组合在以豆饼粉为主要氮源的培养基上发酵水平分别达到5650和5800IU／μl,明显优于以棉籽饼粉为氮源的培养基。GC—91 58组合在2．3t发酵罐中试发酵效价和晶体蛋白含量达到4520IU/μl和0．467％。     

松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

 利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因（Bxvap2）,将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的33.5 %。将表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋白为BXVAP2蛋白。用制备的BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测得抗体灵敏度5.4 ng·mL^-1（效价为1∶1 360 000）,为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。     

苏云金杆菌HBF-1菌株晶体蛋白活化及对金龟幼虫毒力的影响

通过SDS-PAGE研究了缓冲液pH值对HBF-1菌株晶体蛋白的降解活化作用及其对晶体蛋白杀虫毒力的影响.结果表明,晶体蛋白在牛胰蛋白酶和金龟子幼虫中肠液作用下的降解程度,随着缓冲液pH值的增加而加深.幼虫中肠蛋白酶在缓冲液pH值达到8.0时,就能完全降解晶体蛋白;而胰蛋白酶在pH值达到11.0时,才能把晶体蛋白完全降解.产生的活力片段分子量近似,均在63.0kD左右.在pH11.0条件下,胰蛋白酶的降解速度大干幼虫中肠液.生测结果显示,晶体蛋白经中肠液水解后,其毒力明显增强,在7d和14d增效率分别达到1.25和1.00.同时,经强碱性缓冲液处理后,也起到了较强的增效作用.     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究

通过PCR扩增法 ,以cry1Ie1全长基因为模板 ,分别得到不同末端缺失的基因片段 ,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达 ,得到 6种末端缺失蛋白。对小菜蛾生物测定结果表明 ,缺失蛋白IE659、IE656分别缺失了C末端60个和63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的杀虫活性与Cry1Ie1全长蛋白相当 ;IE648、IE045分别缺失了C末端 71个氨基酸残基和N末端缺失44个、C末端缺失63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的活性提高了50% ;IE633、IE105分别缺失了C末端 86个氨基酸残基和N末端缺失 104个、C末端63个氨基酸残基 ,丧失了对小菜蛾的活性。试验明确Cry1Ie1蛋白的最小活性区N端在45～104氨基酸位点之间 ,C端在633～648氨基酸位点之间。     

Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟生长发育和种群增长的影响

以含不同浓度的Cry1Ac毒蛋白的人工饲料(不加毒蛋白为对照)饲喂亚洲玉米螟幼虫,采用实验种群生命表的方法,测定了Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的控害作用。结果显示,含2 000.0ng/g Cry1Ac毒蛋白的人工饲料处理该虫第5天的幼虫存活率为0;200.0、20.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理第10、15天的幼虫存活率、化蛹率、成蛾率、净增长率和种群增长指数均显著低于对照,且高浓度处理显著低于低浓度处理;200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的世代平均周期和种群加倍时间显著长于其它处理;而200.0 ng/g CrylAc毒蛋白处理的周限增长率显著小于2.0、0.2 ng/g处理。表明微量的Cry1Ac毒蛋白对亚洲玉米螟的种群增长有显著影响,且随着浓度的增加控制作用增强。     

一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株

从河北省土壤中分离获得一株苏云金杆菌新分离株ＨＢＦ－１,对其基本生物学特性和知性进行了研究。结果表明,该菌株对黄褐丽金龟幼虫具有特异高杀虫活性,对铜绿丽金电幼虫也表现出较高的杀虫活性。但对棉铃虫和玉米螟等鳞翅目幼虫,以及鞘翅目叶甲科的柳叶甲无杀虫活性。该菌株不产生β－外毒素。其生长对氨基酸需求的测定结果表明,异亮氨酸可抑制缬氨酸和亮氨酸的生物合成代谢,在异亮氨酸的存在下,该菌株对缬氨酸和亮氨酸具有     

利用双亲灭活原生质体融合技术选育高效苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌融合菌株

苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。     

Engineering of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins

Bacillus thuringiensis (Bt) has been used as sprayable pesticides for many decades. Bt strains utilized in these products produce multiple insecticidal proteins to complement a narrow insect specificity of each protein. In the late 1990s, genes encoding Bt insecticidal proteins were expressed in crop plants such as cotton and corn to protect these crops from insect damage. The first Bt protein used in transgenic cotton was Cry1Ac to control Heliothis virescens (tobacco budworm). Cry1Ab was applied to corn to control Ostrinia nubilalis (European corn borer). Since these insects have developed resistance to Cry1Ac and Cry1Ab, new Bt proteins are required to overcome the resistance. In order to protect corn furthermore, it is desired to control Diabrotica virgifera (Western corn rootworm), Helicoverpa zea (corn earworm) and Spodoptera frugiperda (fall armyworm). Recently, many new Bt insecticidal proteins have been discovered, but most of them require protein engineering to meet the high activity standard for commercialization. The engineering process for higher activity necessary for Bt crops is called optimization. The seed industry has been optimizing Bt insecticidal proteins to improve their insecticidal activity. In this review, several optimization projects, which have led to substantial activity increases of Bt insecticidal proteins, are described.     

苏云金杆菌高毒力菌株4．0718的快速选育

从湖南省不同生态区域的旱作地，果园和稻园采集的858份土样中，分离筛选出苏云金杆菌30株。选取一株具典型苏云金杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株701^2c为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，显微涂片染色镜检，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量及芽孢与伴孢晶体的比例与杀虫菌株4．0718。该突变株杀虫毒力与原始菌株相比提高了7．5倍，在6、12和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株的高效速效杀虫毒力经连续10代培养能稳定遗传。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC₅₀为13.1 μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。     

杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定

自烟草中分离获得对南方根结线虫Meloidogyneincognita具有较高杀线活性的拮抗细菌菌株YC-10。研究发现该菌株有伴胞晶体产生,菌体、芽胞形态及生理生化特性与苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种B．thuringiensissubsp．kurstaki相似,16srDNA序列分析表明其与苏云金芽胞杆菌相似性最高,初步确定该菌株为苏云金芽胞杆菌。菌株发酵液及伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2有很强的杀线活性,发酵液处理南方根结线虫,24h线虫死亡率为100％;伴胞晶体蛋白处理南方根结线虫,24h的LC50为5．86μg．mL^-1。研究结果显示该菌株在线虫生物防治上有较大的应用潜力。